Международный эндокринологический журнал 1 (25) 2010

Недосконалість існуючої системи профілактичних оглядів населення з метою раннього виявлення цукрового діабету (ЦД) та патології щитоподібної залози (ЩЗ) є вагомою підставою для нової мобілізації зусиль, скерованих на поліпшення організації первинної медичної допомоги. Таке завдання взяв на себе Український Міжнародний інститут профілактичної медицини, що був заснований у 1978 році на базі кафедри ендокринології і клінічної фармакології Львівського медичного інституту та Львівського обласного ендокринологічного диспансеру. Названий інститут 2006 року увійшов до складу Наукового товариства імені Шевченка.

Методологічною основою нової програми профілактичних оглядів населення були способи ранньої діагностики ЦД: альфа­кетонуричний, альфа­кетонемічний та піруватдегідрогеназний (ПДГ) тести.

Методи ранньої діагностики метаболічних порушень

Обстеження населення з метою раннього виявлення ендокринної патології передбачає впровадження досліджень функціонального стану циклу Корі та піруватдегідрогеназної системи мітохондрій лейкоцитів, які включають альфа­кетонуричний, альфа­кетонемічний та піруватдегідрогеназний тести.

Піруватдегідрогеназний тест в епідеміологічних дослідженнях вуглеводного обміну

У програмі обстеження населення піруватдегідрогеназний тест використовується з метою диференціації інсулінорезистентності вітамінонезалежної та В1­гіповітамінозу, що віддзеркалений показниками зниженої функціональної активності піруватдегідрогеназного комплексу та надмірної екскреції з сечею a­кетокислот.

В основу методів визначення активності піруват­ та a­кетоглютаратдегідрогенази з фериціанідом покладений принцип відновлення фериціаніду калію (К3[Fe(CN)6]), що нерозривно пов’язане з окисленням кетокислоти. Для зручності у прописі наведені не тільки назви реактивів, але й склад проби, що підлягає інкубації.

У дослідну і контрольну пробірки вносять такі реактиви (табл. 1).

Дослідну пробу інкубують 20 хв при 37 °С у водяній бані або термостаті (для спрощення процедури пацієнт може тримати пробірку в п’ястку або під пахвою). Після інкубації реакцію зупиняють, вносячи у пробірку 0,3 мл 50% розчину трихлороцтової кислоти (ТХО). У конт­рольну пробірку ТХО вносять безпосередньо після забору крові.

Після цього проби центрифугують і фотометрують проти Н2О на фотоелектроколориметрі (ФЕК, синій світлофільтр, 440 нм, кювета з довжиною оптичного шляху 5 мм) або спектрофотометрі при 417 нм. Кількість відновленого фериціаніду калію визначають за калібрувальною кривою, активність ферменту виражають у мкмоль/(с.­л) (табл. 2).

Наведені показники оптичної щільності використовують для побудови калібрувальної кривої розведень стандартного розчину фериціаніду (табл. 3).

Результати виконаних досліджень (табл. 3) підтверджують наявність лінійної залежності величин оптичної щільності від показників вмісту фериціаніду в пробі.

Визначення ціни сотої частки (0,01) шкали ФЕК у мкмоль/(с.­л) піруватдегідрогеназної активності крові:

Для обчислення ПДГ­активності крові використовують таку формулу:

де К — оптична щільність контролю; Д — оптична щільність досліду; 6,7 — концентрація фериціаніду, мкмоль/мл; 0,7 — об’єм розчину фериціаніду в пробі, мл; 1000 — коефіцієнт для розрахунку у мкмоль/л; 0,35 — оптична щільність стандартного розчину фериціаніду (4,69 мкмоля у пробі); 0,04 — кількість крові, витраченої для аналізу, мл; 0,01 — коефіцієнт для перечислення на соту частку шкали ФЕК; 1200 — кількість секунд у 20 хвилинах.

Полегшує розрахунки наступна таблиця (табл. 4).

У здорових людей ПДГ­активність крові віддзеркалена величинами оптичної щільності у межах 0,03–0,06, що становить 8,4–16,8 мкмоль/(с.­л), М = 12,6 ± ± 0,15 мкмоль/(с.­л), Р < 0,01.

Альфа­кетонуричний та альфа­кетонемічний тести

У діагностиці порушень вуглеводного обміну важливого значення набувають дослідження вмісту a­кетокислот (a­кетоглютарату та пірувату) у крові та сечі.

Піровиноградна кислота утворюється в тканинах у процесі розпаду вуглеводів (глюкози та глікогену), ряду амінокислот (аланіну, серину, цистеїну, цистину, гліцину, треоніну), а також при дегідруванні молочної кислоти. Піровиноградна кислота може перетворюватись на ацетилкоензим А, окислення якого в циклі трикарбонових кислот забезпечує синтез АТФ. Вона бере участь у біосинтезі ацетилнейрамінової кислоти, глюкози, глікогену. Піруват має велике значення в обміні речовин у центральній нервовій системі.

Альфа­кетоглютарова кислота утворюється в циклі Кребса; через a­кетоглютарат вуглецеві скелети п’яти амінокислот (аргініну, гістидину, глютамінової кислоти, глютаміну та проліну) включаються у цикл трикарбонових кислот. Безпосереднім попередником a­кетоглютарату є глютамінова кислота. У здорової людини з сечею за добу виводиться 10–25 мг піровиноградної та 21–44 мг a­кетоглютарової кислот, сумарно — 31–69 мг.

Визначення сумарного вмісту a­кетокислот у сечі модифікованим методом Умбрайта

Принцип: піруват та a­кетоглютарат сечі конденсуються з 2,4­динітрофенілгідразином (ДНФГ) з утворенням гідразону, який у лужному середовищі дає червоно­оранжеве забарвлення розчину. Це дозволяє визначати їх вміст у крові та сечі.

Обладнання:

1. Фотоелектроколориметр.

2. Дві пробірки (5 мл) — можуть бути ампули для дистильованої води, новокаїну чи ізотонічного розчину NaCl.

3. Піпетка — може використовуватись інсуліновий шприц.

Реактиви:

1. Розведена соляна (хлористоводнева) кислота (HCI, 8,33%) — можна придбати в аптеці.

2. Солянокислий 0,1% розчин 2,4­динітрофеніл­гідразину. 50 мг реактиву розчиняють у 30 мл розведеної соляної кислоти (8,33%) при слабкому підігріванні суміші. Розчин залишають до наступного дня, тоді його об’єм доводять до 50 мл дистильованою водою.

3. Розчин натрію гідроокису (NaOH) — 12 г/100 мл.

Хід визначення:

У дві пробірки (5 мл) — дослідну і контрольну вносять:

— H2O — 0,5 мл у дослідну та 0,6 мл у контрольну;

— ДНФГ — по 0,4 мл у дослідну і контрольну;

— сечу — лише 0,1 мл у дослідну пробірку.

Вміст пробірок змішують після додавання кожного реактиву і на 20 хв залишають у темному місці при кімнатній температурі. Потім у пробірки додають по 1 мл 12 % розчину NaOH, змішують і через 5 хв колориметрують інтенсивність червоно­оранжевого забарвлення досліду щодо контролю (ФЕК, світлофільтр синій 490 нм, кювета з довжиною оптичного шляху — 5 мл). Показники оптичної щільності переводять у мкмоль/л, помноживши кожен з них на 5000.

Визначення сумарного вмісту a­кетокислот (пірувату та a­кетоглютарату) у крові

Альфа­кетонемічний тест використовується на етапі первинної медико­соціальної опіки населення з метою ранньої діагностики цукрового діабету. При цьому досліджується рівень a­кетокислот та глюкози на 120­й хвилині після прийому стандартного сніданку, що містить 100 г вуглеводів (200 г білого хліба і 3 чайні ложки цукру (20 г) на 300 мл води). Вміст a­кетокислот крові в умовах вуглеводного навантаження віддзеркалює стан активації гліколізу, циклу трикарбонових кислот та піруватдегідрогеназної системи мітохондрій лейкоцитів, що контролюється інсуліном. Отже, a­кетонемічний тест є маркером функціонального стану b­клітин панкреатичних острівців.

Хід визначення

З пальця беруть 0,1 мл крові і змішують її у центрифужній пробірці з 0,5 мл H2O з метою гемолізу еритроцитів. До гемолізату додають 0,2 мл 50% розчину трихлороцтової кислоти, перемішують вміст скляною паличкою і через 2–3 хв центрифугують при 1500 об/хв. Надосадову рідину цілком зливають у суху пробірку, до неї додають 0,4 мл 0,1% солянокислого розчину 2­4­динітрофенілгідразину. Вміст пробірки перемішують і на 20 хв залишають у темному місці при кімнатній температурі. Після цього у пробірку доливають 1 мл 12% розчину NaOH і через 5 хв визначають на ФЕКу оптичну щільність забарвленого розчину (у нормі оптична щільність — 0,045–0,09, що становить 225–450 мкмоль/л, або 1,98–3,96 мг%). Як компенсаційну рідину використовують контрольний розчин, що містить 0,6 мл H2O.

Колориметрують проби на ФЕКу із синім світлофільтром (490 нм) у кюветах з довжиною оптичного шляху 5 мм. При обчисленні вмісту a­кетокислот у крові та сечі використовують таблиці (табл. 5–7).

Табл. 5, 6 складені на підставі даних калібрувальної кривої розведень стандартного розчину пірувату — 5000 мкмоль/л (44 мг%) (табл. 7).

Спосіб приготування стандартного розчину піровиноградної кислоти (5000 мкмоль/л) та його розведень

55 мг пірувату натрію (відповідає 44 мг чистої піровиноградної кислоти) розчинити у 100 мл дистильованої води. У домашніх умовах 50 мг пірувату натрію (40 мг чистого пірувату) урівноважують 1 краплею Н2О на аналітичній вазі, складеній із 4 інсулінових шприців. Наважку розчиняють у 90,91 мл Н2О. Для побудови калібрувальної кривої цей стандартний розчин розводять (табл. 9).

Приклад діагностики феохромоцитоми

Хвора К., 45 років, протягом останніх 9 місяців безуспішно лікується з приводу гіпертонічної хвороби. Рівень альфа­кетокислот у сечі становить 5000 мкмоль/л (44 мг%), що вказує на інсулінорезистентність п’ятого ступеня і дає підставу запідозрити феохромоцитому. Ультразвукове дослідження виконала Л.Я. Міклош (Львівський діагностичний центр). Діагноз підтвердився — виявлено аденому правої надниркової залози. Операцію здійснив лапароскопічним методом академік АМН України, професор М.П. Павловський. Через місяць після операції (28.01.2009 р.) рівень альфа­кетокислот знизився з 5000 мкмоль/л до 2050 мкмоль/л, а ступінь інсулінорезистентності зменшився з V до ІІ за піруватуричним тестом, нормалізувався артеріальний тиск.

Виконані дослідження дають підставу для широкого впровадження a­кетонуричного тесту з метою діагностики стану інсулінорезистентності та раннього виявлення феохромоцитоми.

Частота вітамінонезалежної інсулінорезистентності циклу Корі у загальній популяції становить 15,41 % (табл. 10).

Як виходить із табл. 10, вітамінонезалежну інсулінорезистентність діагностовано у 45 осіб (15,41%) із надлишком маси тіла. Її ознаками є показники надмірної екскреції з сечею альфа­кетокислот на фоні нормальної або підвищеної ПДГ­активності крові. Частота В1­вітамінної недостатності у загальній популяції становить 5,82 %. У таких осіб збільшений вміст альфа­кетокислот у сечі зумовлений декомпенсованою піруватдегідрогеназною недостатністю (В1­гіповітаміноз), що було констатовано у 30 осіб.

Прихований гіпотиреоз зі збільшенням ЩЗ (йодо­дефіцитний стан) діагностовано у 6 осіб із 292 обстежених (2,06 %). Маркерами такого стану були низька піруватдегідрогеназна активність крові (3,41– 7,80 ммоль/(с.­л) та низький вміст альфа­кетокислот у сечі, що зібрана через 2 години після стандартного вуглеводного сніданку (3,0–4,8 мг), як це наведено в табл. 11.

Стає очевидним (табл. 11), що частота прихованого гіпотиреозу (йододефіцитного стану) у загальній популяції становить 2,06 % серед населення Прикарпатського регіону.

Гіперінсулінізм є вагомим фактором ризику розвитку ЦД, тому діагностика цього синдрому в загальній популяції має важливе профілактичне значення (табл. 12).

При аналізі даних табл. 12 звертає на себе увагу у практично здорових осіб підвищена ПДГ­активність крові (17,47–26,60 мкмоль/(с.­л)), вона асоціюється з нормальними або пониженими показниками екскреції з сечею альфа­кетокислот (3,0–9,6 мг), що є характерним для синдрому первинного гіперінсулінізму. Його частота в загальній популяції становить 2,4 %.

У цілому на підставі отриманих спостережень можна рекомендувати критерії діагностики порушень вуглеводного обміну в загальній популяції (табл. 13).

Результати досліджень інсулінорезистентності наведені у табл. 14, 15.

На підставі виконаних епідеміологічних обстежень 29 753 осіб Прикарпатського регіону складено програму ранньої діагностики.

Рання діагностика цукрового діабету за піруватуричним тестом

Використовується самоконтроль вуглеводного обміну візуальним методом у домашніх умовах. Об’єктом дослідження служать a­кетокислоти (піруват, a­кетоглютарат, оксалоацетат) сечі нічної або зібраної протягом дня, бажано через 2 години після стандартного вуглеводного сніданку (200 г білого хліба і 20 г (3 чайні ложки) цукру на півтори склянки (300 мл) води).

Обладнання:

1. Одна пробірка (5 мл) — може бути ампула для дистильованої води, новокаїну чи ізотонічного розчину NaCl.

2. Піпетка — використовується інсуліновий шприц.

3. Кольорова шкала (додається) для візуальної діагностики п’яти ступенів інсулінорезистентності (І ступінь — 90 мкмоль/л, ІІ ступінь — 1800 мкмоль/л, ІІІ ступінь — 2700 мкмоль/л, ІV ступінь — 3600 мкмоль/л і V ступінь — 4500 мкмоль/л).

Реактиви:

— Розведена соляна кислота (HCl, 8,33%), можна придбати в аптеці.

— Солянокислий 0,1% розчин 2,4­динітрофенілгідра­зину: 50 мг реактиву (урівноважується однією краплею води на домашній аналітичній вазі нашої конструкції) розчиняють у 30 мл розведеної соляної кислоти (8,33%) при слабкому підігріванні суміші. Її залишають до наступного дня, коли об’єм розчину доводять до 50 мл.

— Розчин натрію гідроокису (NaOH) — 12 г/100 мл.

Хідвизначення:

У пробірку вносять: 0,5 мл H2O, 0,4 мл ДНФГ і 0,1 мл сечі.

Вміст пробірки змішують після додавання кожного реактиву і на 20 хв залишають у темному місці при кімнатній температурі. Потім у пробірки додають 1 мл 12% розчину NaOH, змішують і через 5 хв порівнюють інтенсивність червоно­оранжевого забарвлення розчину дослідної пробірки із кольоровою шкалою.

Наводимо приклад. Пацієнт Ц., 1980 р.н., із надлишком маси тіла. Клінічний діагноз: метаболічний синдром. 23.12.2008 р. інтенсивність забарвлення нічної порції сечі відповідає концентрації стандартного розчину пірувату величиною 1800 мкмоль/л за кольоровою шкалою, що свідчить про інсулінорезистентність (ІІ ступінь) механізмів глюконеогенезу в циклі Корі і є фактором ризику щодо можливого розвитку цукрового діабету.

Протидіабетична розвантажуюча дієтотерапія

Наша програма розвантажуючої дієтотерапії (ПРД) у семиденному циклі передбачає використання молочної (понеділок, середа, п’ятниця) та овочевої (вівторок, четвер, субота) дієт (табл. 16).

Приклад молочної дієти (1804 ккал): спожити за добу 1500 мл кефіру або квасного молока і 350 г свіжого сиру, поділивши їх на 7 порцій, у кожній з них одна склянка (200 мл) кефіру та три столові ложки (50 г) сиру. Інтервал між прийомами їжі становить 2 години (7.00–9.00–11.00–13.00–15.00–17.00–19.00). Добова кількість чорного хліба — 50 г.

Приклад овочевої дієти (1819 ккал): спожити за добу 1600 г салату без солі, заправленого 20 г (дві столові ложки) нерафінованої соняшникової або маслинової олії, цибулею, кмином, лимонним соком, і 600 г свіжого сиру, поділивши їх на 10 порцій. Інтервал між прийомами їжі — 90 хв (7.00–8.30–10.00–11.30–13.00–14.30–16.00–17.30–19.00–20.30). Кожна порція містить 160 г салату і 4 столові ложки (60 г) сиру.

Така дієта містить мало вітамінів, особливо вітамінів А і D, їх бажано додавати у кількостях, що забезпечують добову потребу. Якщо маса тіла знижується, то через 1 місяць можна додавати 50 г чорного хліба і 5 г вершкового масла на добу, а далі рекомендувати ще два такі додавання з одномісячним інтервалом. Після цього склад дієти не змінюють до настання бажаного зниження маси тіла.

У випадку надмірного зниження маси тіла — більше ніж 4 кг на місяць, дієту слід розширювати переважно за рахунок збільшення кількості жирів.

Хворим, які не можуть дотримуватись дієти через підвищене відчуття голоду, показане застосування одного із препаратів групи метформіну.

Приклад динамічного спостереження у програмі самоконтролю вуглеводного обміну

Студент П., 1987 р. нар., клінічний діагноз: метаболічний синдром. Маса тіла 95 кг, зріст 190 см. 10.12.2008 р. рівень альфа­кетокислот у сечі нічній (200 мл) — 0,36 оптичної щільності (о.щ.) = 1800 мкмоль/л (норма: 350 — 700 мкмоль/л), що вказує на інсулінорезистентність ІІІ ст. у циклі Корі. Перебуваючи протягом 1 місяця на розвантажуючій дієті, схуд на 4 кг. 15.01.2005 р. рівень альфа­кетокислот у нічній сечі (1000 мл) — 0,065 о.щ. = 325 мкмоль/л свідчить про нормалізацію функціонального стану циклу Корі (глюконеогенезу) і добрі результати дієтотерапії.

Застосування колориметричного дослідження сумарного вмісту a­кетокислот у сечі дозволяє визначити 9 ступенів інсулінорезистентності у циклі Корі (табл. 17).