Международный эндокринологический журнал 4 (28) 2010

Введение

Среди многообразия факторов, способных оказывать повреждающее действие на живой организм, особое место занимает ионизирующая радиация. Опасность негативного воздействия радиационного излучения связана с бурно развивающейся в последние десятилетия атомной энергетикой и широким применением в медицине радио­изотопных методов диагностики и лечения. Эффекты действия ионизирующего излучения запускают в живом организме каскад биохимических процессов, приводящих к преждевременному старению на всех уровнях организма — клеточном, тканевом, органном.

Щитовидная железа (ЩЖ) является самым радиочувствительным органом из всех жизненно важных органов. Поэтому важно провести сравнительное изучение эффектов облучения ЩЖ в зависимости от возраста, так как функция ЩЖ изменяется при старении организма и ионизирующая радиация может еще более усугубить возникновение возрастных дисфункций, что существенным образом отразится как на взаимосвязанной деятельности нейроэндокринной системы, так и на функции других органов и систем, прежде всего сердца и сосудов.

Помимо йодсодержащих гормонов, ЩЖ продуцирует ряд биологически активных веществ, влияющих на различные физиологические процессы. В данной работе проведена оценка экспрессии двух таких веществ, являющихся маркерами основных биологических процессов, обеспечивающих функционирование ЩЖ и лежащих в основе неопластической трансформации, — пролиферации и апоптоза клеток. Такими биологически активными веществами являются белок Ki­67 — клеточный маркер пролиферации, экспрессия которого неодинакова в клетках щитовидной железы людей разных возрастных групп [1], а также белок Р53, осуществляющий контроль над течением процессов клеточного цикла, а также за отсутствием в геноме повреждений, которые могли бы привести к дальнейшему развитию патологии. Р53­зависимый апоптоз — мощный селектор, позволяющий избежать накопления мутаций, а в случае, когда они уже возникли, Р53­зависимый апоптоз позволяет элиминировать такие потенциально опасные для организма клетки [2]. Белок Р53 играет важную роль и в первичном ответе организма на действие радиации. Подтверждением этого являются результаты эксперимента по облучению мышей. Массовый апоптоз, происходящий в радиочувствительных тканях мышей Р53­дикого типа вскоре после облучения гамма­излучением, не наблюдается у Р53­негативных животных [3].

Цель исследования — изучение возрастной динамики процессов пролиферации и апоптоза фолликулярных клеток щитовидной железы у человека и крыс как при естественном, так и при индуцированном (радиационном) старении.

Материал и методы исследования

Объектом исследования послужили ЩЖ людей разных возрастных групп, полученные при аутопсиях. Весь материал был разделен на 3 группы:

1. Люди пожилого возраста (60–74 лет, n = 43).

2. Люди старческого возраста (75–89 лет, n = 34).

3. Долгожители (90 лет и старше, n = 22).

Также исследования были проведены на 40 самцах крыс линии Вистар. Все животные были разделены на 4 группы:

1­я — необлученные крысы 3­месячного возраста (молодые животные);

2­я — необлученные крысы 24­месячного возраста (старые животные);

3­я — облученные крысы 3­месячного возраста (молодые животные);

4­я — облученные крысы 24­месячного возраста (старые животные).

Фрагменты ЩЖ фиксировали в нейтральном растворе формалина (pH = 7), проводили через спирты, ксилолы и заливали в парафин по стандартной методике. Для морфологического изучения срезы окрашивали гемато­ксилином и эозином.

Для верификации экспрессии в тканях ЩЖ белков Ki­67 и Р53 был использован иммуногистохимический метод. Срезы толщиной 3–5 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли­L­лизина. Использовали первичные моноклональные антитела к Ki­67 (1 : 500, Dako), Р53 (1 : 500, Dako). В качестве вторых антител использовали биотинилированные антитела (Dako). Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC­kit) с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Dako).

Количественную оценку результатов исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4, программного обеспечения АСТ­1 (версия 2.12) и «Видеотест­Морфология» (версия 5.0). Определяли три параметра: оптическую плотность (в относительных единицах), среднюю яркость (в относительных единицах) и суммарную площадь иммуноокрашенных структур (%).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы Statistica 6.0. Для проверки неоднородности 3 групп использовали непараметрический критерий ANOVA Kruskal — Wallis; для оценки неоднородности 2 групп использовали непараметрический критерий Mann — Whitney U­test. Для анализа распределения использовали критерий Шапиро — Уилка.

Результаты исследования и их обсуждение

Верификацияэкспрессиибелка Ki­67 в ЩЖ людей разных возрастных групп. При светооптическом исследовании наблюдается снижение экспрессии белка Ki­67 в тиреоцитах людей с возрастом. У людей пожилого возраста она наблюдалась практически во всех тиреоцитах, тогда как в группе долгожителей лишь в единичных случаях. Статистическая обработка данных подсчета оптической плотности иммуноокрашенных тиреоцитов выявила достоверное (Р < 0,05) снижение оптической плотности тиреоцитов с экспрессией белка Ki­67 с возрастом: достоверные различия обнаружены между 1­й и 3­й группами людей (Р < 0,05). Максимальное среднее значение этого показателя зафиксировано в группе людей пожилого возраста (0,185 усл.ед.), минимальное среднее значение оптической плотности установлено для группы долгожителей (0,113 усл.ед.).

Было проведено сравнение средних значений средней яркости для иммуноокрашенных тиреоцитов разных возрастных групп. Значения данного показателя оказываются инвертированы, поскольку компьютерная программа Morphology 5.0. позволяет сравнить среднюю яркость с абсолютным черным: чем ярче окрашена структура, тем ниже значение средней яркости.

Статистическая обработка данных выявила достоверное (Р < 0,05) снижение значений суммарной площади иммуноокрашенных структур с возрастом: достоверные различия обнаружены между 1­й и 3­й группами людей (Р < 0,05). Наибольшее среднее значение иммуноокрашенных тиреоцитов наблюдается в группе людей пожилого возраста (57,154 %), тогда как наименьшее значение этот показатель принимает в группе долгожителей (25,056 %).

Верификация экспрессиибелка Ki­67 вЩЖ крыс разных возрастных групп прииндуцированном (радиационном) старении. Для верификации экспрессии белка Ki­67 в фолликулярных клетках ЩЖ облученных и необлученных крыс были выбраны 2 возрастные группы: крысы 3­месячного возраста (молодые животные) и крысы в возрасте 24 месяцев (старые животные). На срезах ЩЖ облученных крыс обеих возрастных групп встречаемость окрашенных тиреоцитов визуально снижается по сравнению с необлученными крысами.

Оценивали два параметра: оптическую плотность и суммарную площадь иммуноокрашенных структур. Подсчет суммарной площади иммуноокрашенных структур и последующая статистическая обработка полученных данных показали, что с вероятностью Р < 0,05 происходит снижение количества тиреоцитов, экспрессирующих белок Ki­67, в группе крыс, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации. В группе облученных молодых крыс этот показатель принимает значение 0,908 ± 0,023 %, в то время как для группы необлученных молодых крыс суммарная площадь иммуноокрашенных структур составляет 3,209 ± 0,028 %. Снижение суммарной площади иммуноокрашенных структур происходит и в группе крыс 24­месячного возраста. Здесь этот показатель для облученных животных принимает значение 0,798 ± 0,013 %, а для необлученных — 2,700 ± 0,021 %.

Подсчет оптической плотности иммуноокрашенных клеток выявил увеличение экспрессии белка Ki­67 в тиреоцитах крыс, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации. При статистической обработке значений оптической плотности иммуноокрашенных тиреоцитов группы крыс 3­месячного возраста (0,892 ± 0,027 усл.ед. для облученных животных и 0,702 ± 0,019 усл.ед. для необлученных) и группы крыс 24­месячного возраста (1,013 ± 0,041 усл.ед. для облученных животных и 0,799 ± 0,010 усл.ед. для необлученных) было показано, что значения оптической плотности статистически значимо (Р < 0,05) выше у облученных животных в каждой возрастной группе.

Было проведено исследование уровня пролиферации тиреоцитов людей пожилого, старческого возраста и долгожителей, а также уровня пролиферации тиреоцитов облученных и необлученных крыс разных возрастных групп.

На основании оценки оптической плотности, средней яркости и суммарной площади иммуноокрашенных фолликулярных клеток щитовидных желез людей можно сделать вывод о том, что с возрастом пролиферативные процессы в ЩЖ становятся все менее выраженными, что и является одной из причин старческой инволюции органа.

Данные, полученные на крысах, показали, что уровень пролиферации ткани ЩЖ также снижается с возрастом, но только за счет уменьшения количества клеток, экспрессирующих пролиферативный белок Ki­67. После воздействия ионизирующей радиацией количество клеток, способных к росту и делению, резко падает, но уровень экспрессии пролиферативного белка Ki­67 в оставшихся активных клетках повышается. Возможно, это является компенсацией.

После облучения сохраняется тенденция к снижению числа активно делящихся тиреоцитов и повышению в них концентрации белка пролиферации Ki­67.

Верификация экспрессиибелкаР53 вщитовидных железах людей. При светооптическом исследовании наблюдается увеличение экспрессии белка Р53 в тиреоцитах людей с возрастом. Экспрессия белка Р53 у людей пожилого возраста наблюдается в единичных случаях, тогда как в группе долгожителей практически во всех тиреоцитах.

Оценивали 3 параметра: оптическую плотность, среднюю яркость и суммарную площадь иммуноокрашенных структур.

Статистическая обработка данных оптической плотности иммуноокрашенных тиреоцитов выявила достоверное (Р < 0,05) увеличение оптической плотности тиреоцитов с экспрессией белка Р53 с возрастом: достоверные различия (Р < 0,05) наблюдаются между 1­й и 3­й группами. Минимальное среднее значение этого показателя было зафиксировано в группе людей пожилого возраста (0,138 ± 0,019 усл.ед.), максимальное среднее значение оптической плотности установлено для группы долгожителей (0,186 ± 0,021 усл.ед.).

Статистическая обработка данных средних значений средней яркости для разных возрастных групп выявила достоверное (Р < 0,05) увеличение средней яркости тиреоцитов с экспрессией белка Р53 с возрастом: достоверные различия (Р < 0,05) наблюдаются между 1­й и 3­й группами. Минимальная яркость была зафиксирована в группе людей пожилого возраста (191,135 ± 10,896 усл.ед.), максимальное среднее значение яркости установлено для группы долгожителей (163,106 ± 13,787 усл.ед.).

Подсчет суммарной площади иммуноокрашенных структур по белку Р53 позволил сделать вывод о сохранении значения этого показателя на протяжении исследуемого отрезка онтогенеза человека. Было проведено сравнение средних значений суммарной площади иммуноокрашенных структур по маркеру Р53 для разных возрастных групп. Максимальное среднее значение (51,823 %) выявлено для группы людей пожилого возраста, минимальное (39,867 %) — для группы долгожителей. Тем не менее тенденции к снижению экспрессии белка Р53 не наблюдается, т.к. ошибки этих величин перекрываются между собой. Статистическая обработка данных также не выявила различий между тремя выборками (Р = 0,49).

Верификация экспрессии белкаР53 вЩЖ облученных и не облученных крыс разныхвозрастных групп. Для верификации экспрессии белка Р53 в фолликулярных клетках ЩЖ облученных и необлученных крыс были выбраны 2 возрастные группы: крысы 3­месячного возраста и крысы 24­месячного возраста. Проведен количественный анализ по 2 параметрам: оптической плотности и суммарной площади иммуноокрашенных структур.

Подсчет суммарной площади иммуноокрашенных структур и последующая статистическая обработка полученных данных показали, что с вероятностью Р < 0,05 количество тиреоцитов, экспрессирующих белок Р53, увеличивается с возрастом как среди облученных крыс, так и среди необлученных. В группе облученных крыс 3­месячного возраста этот показатель принимает значение 4,101 ± 0,029 %, в то время как для группы необлученных крыс 3­месячного возраста суммарная площадь иммуноокрашенных структур составляет 1,903 ± 0,024 %. Повышение суммарной площади иммуноокрашенных структур происходит и в группе крыс 24­месячного возраста. Здесь этот показатель для облученных животных принимает значение 5,295 ± 0,021 %, а для необлученных — 3,100 ± 0,018 %.

При статистической обработке значений оптической плотности иммуноокрашенных тиреоцитов группы крыс 3­месячного возраста (1,105 ± 0,018 усл.ед. для облученных животных и 0,806 ± 0,022 усл.ед. для необлученных) и группы крыс 24­месячного возраста (1,197 ± 0,025 усл.ед. для облученных животных и 0,999 ± 0,038 усл.ед. для необлученных) было показано, что значения оптической плотности статистически значимо (Р < 0,05) выше у облученных животных в каждой возрастной группе.

Было проведено исследование уровня апоптотической активности тиреоцитов людей пожилого, старческого возраста и долгожителей, а также уровня антипролиферативной активности тиреоцитов облученных и необлученных крыс разных возрастных групп.

На основании оценки оптической плотности, средней яркости и суммарной площади иммуноокрашенных фолликулярных клеток щитовидных желез людей можно сделать вывод о том, что экспрессия проапоптотического белка Р53 и количество экспрессирующих этот белок клеток увеличивается с возрастом.

Данные, полученные на крысах, показали, что после воздействия ионизирующей радиацией экспрессия про­апоптотического белка Р53 в тиреоцитах и количество таких тиреоцитов резко увеличивается.

Оценка баланса пролиферации иапоптозав разных возрастных группах людей, атакже облученных и не облученных крыс. Оценка баланса пролиферации и апоптоза в тиреоцитах в разных возрастных группах проводилась на основании оценки уровней экспрессии белка пролиферации Ki­67 и проапоптотического белка Р53 по двум параметрам: оптическая плотность и суммарная площадь иммуноокрашенных структур.

Баланс пролиферации и апоптоза на основании оценки оптической плотности у людей с возрастом смещается в сторону апоптоза.

Экспрессия белка Р53 коррелирует (r = –0,977) с экспрессией белка Ki­67. Значения разницы в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 следующие: 0,047 — в группе людей пожилого возраста; –0,04 — в группе людей старческого возраста; –0,073 — в группе долгожителей. Разница в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 соотносится с возрастом человека: чем больше возраст пациента, тем больше экспрессия белка Р53 превалирует над экспрессией белка Ki­67. Таким образом, с возрастом баланс пролиферации и антипролиферативной активности смещается в сторону антипролиферативной активности.

Баланс пролиферации и апоптоза на основании оценки суммарной площади иммуноокрашенных тиреоцитов у людей с возрастом изменяется, смещаясь в сторону апоптоза.

Корреляционный анализ полученных данных показал, что экспрессия белка Ki­67 коррелирует с экспрессией белка Р53 (r = 0,966). Значения разницы в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 следующие: 2,331 — в группе людей пожилого возраста; –14,976 — в группе людей старческого возраста и –14,811 — в группе долгожителей. Разница в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 соотносится с возрастом человека: чем больше возраст пациента, тем больше экспрессия белка Р53 превалирует над экспрессией белка Ki­67.

Баланс пролиферации и апоптоза в щитовидной железе на основании оценки оптической плотности у необлученных крыс с возрастом изменяется; процесс апоптоза начинает сильнее доминировать над процессами пролиферации.

Значения разницы в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 следующие: –0,104 — в группе крыс 3­месячного возраста и –0,2 — в группе крыс 24­месячного возраста. Разница в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 соотносится с возрастом крыс: чем старше крыса, тем больше экспрессия белка Р53 превалирует над экспрессией белка Ki­67.

Баланс пролиферации и апоптоза на основании оценки суммарной площади иммуноокрашенных тиреоцитов у необлученных крыс с возрастом смещается в сторону апоптоза.

Значения разницы в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 следующие: 1,306 — в группе крыс 3­месячного возраста; –0,4 — в группе крыс 24­месячного возраста. Разница в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 соотносится с возрастом крыс: чем старше крыса, тем больше экспрессия белка Р53 превалирует над экспрессией белка Ki­67.

Анализ параметров оптической плотности показал, что баланс пролиферации и апоптоза у облученных крыс 3 мес. по сравнению с необлученными крысами 3 мес. изменяется: процесс апоптоза начинает сильнее доминировать над процессами пролиферации.

Значения разницы в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 следующие: –0,104 — в группе необлученных крыс 3­месячного возраста и –0,213 — в группе облученных крыс 3­месячного возраста.

Анализ оптических плотностей показал, что баланс пролиферации и апоптоза у облученных крыс 24 мес. изменяется по сравнению с необлученными крысами 24 мес.

Значения разницы в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 следующие: –0,2 — в группе необлученных крыс 24­месячного возраста и –0,184 — в группе облученных крыс 24­месячного возраста.

Анализ суммарной площади иммуноокрашенных структур показал, что баланс пролиферации и апоптоза у облученных крыс 3 мес. по сравнению с необлученными крысами 3 мес. смещается в сторону апоптоза.

Значения разницы в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 следующие: 1,306 — в группе необлученных крыс 3­месячного возраста и –3,193 — в группе облученных крыс 3­месячного возраста.

Анализ суммарной площади иммуноокрашенных структур показал, что баланс пролиферации и апоптоза изменяется у облученных крыс 24 мес. по сравнению с необлученными крысами 24 мес.

Значения разницы в уровнях экспрессии белков Ki­67 и Р53 следующие: –0,4 — в группе необлученных крыс 24­месячного возраста и –4,497 — в группе облученных крыс 24­месячного возраста.

Полученные данные указывают на то, что с возрастом, как у людей, так и у крыс, антипролиферативные процессы и апоптоз начинают доминировать над процессами пролиферации, что является одной из причин старческой инволюции органа.

У людей до 75 лет процессы пролиферации в щитовидной железе преобладают над процессами апоптоза, но к 90 годам антипролиферативные процессы и апоптоз окончательно доминируют над пролиферацией. На это указывает и снижение экспрессии пролиферативного белка Ki­67 на фоне увеличения экспрессии проапоптозного фактора Р53, и уменьшение количества тиреоцитов, экспрессирующих белок Ki­67, на фоне повышения количества тиреоцитов, экспрессирующих белок Р53. Подобные данные были получены и при исследовании щитовидных желез крыс.

При воздействии ионизирующей радиации в тиреоцитах как молодых, так и старых крыс резко увеличивается количество повреждений, возрастает антипролиферативная активность и, соответственно, возможный уровень апоптоза. В то же время количество клеток, способных к активному делению и росту, резко уменьшается. При этом наблюдается интенсификация процессов пролиферации за счет клеток, сохранивших способность к росту и делению. Во всех возрастных группах животных баланс пролиферативной активности и апоптоза после облучения достоверно смещается в сторону антипролиферативной активности и клеточной гибели.

Выводы

1. При старении происходит снижение пролиферативной активности тиреоцитов в щитовидной железе человека. Индуцированное старение (воздействие ионизирующей радиации) приводит к уменьшению суммарной площади экспрессии белка Ki­67 в щитовидной железе старых крыс, однако усиливает пролиферативную активность тиреоцитов в молодом возрасте, что является потенциально неблагоприятным для формирования опухолевых очагов в щитовидной железе.

2. Зарегистрировано возрастное усиление процессов апоптоза клеток щитовидной железы у человека. Воздействие ионизирующей радиации приводит к активации процессов апоптоза в щитовидной железе крыс различного возраста. Сравнение показателей экспрессии проапоптозного фактора Р53 у необлученных животных свидетельствует об усилении под действием радиации естественных инволютивных процессов, способствующих программированной клеточной гибели.

3. На основании оценки баланса процессов пролиферации и апоптоза в щитовидной железе человека и крыс показано преобладание антипролиферативных процессов при старении. Воздействие ионизирующей радиации приводит к смещению баланса между процессами пролиферации и апоптоза в щитовидной железе крыс в сторону усиления клеточной гибели.

4. Однотипность динамики баланса пролиферативной активности и апоптоза клеток щитовидной железы у человека и крыс позволяет экстраполировать результаты экспериментальных исследований на человека. Возрастное снижение пролиферативной активности тиреоцитов у человека и смещение баланса процессов пролиферации и апоптоза при действии радиации в сторону клеточной гибели, прогрессирующее с возрастом у крыс, позволяет рассматривать старение как фактор, снижающий риск возникновения радиационно­индуцируемого рака щитовидной железы.