Журнал «Травма» Том 10, №2, 2009

Изучению остеогенного потенциала мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в последнее время уделяется значительное внимание. В большом количестве экспериментальных работ убедительно показано, что при определенных условиях МСК начинают формировать остеоноподобные структуры [44, 56-58, 60, 68]. В ряде работ показана клиническая эффективность МСК в восстановлении остеорепаративных процессов [5, 16, 25, 27, 43]. Но несмотря на значительное количество публикаций, в доступной литературе нам не удалось найти работ, посвященных изучению механизмов влияния МСК на процессы репаративного остеогенеза. Хорошо известно, что клетка как самостоятельная биологическая единица осуществляет свое воздействие на окружающие ее клетки и сама находится под воздействием окружающих клеток. Реализация таких межклеточных взаимодействий осуществляется за счет рецепторов, имеющихся на поверхности клеточной мембраны и продуцируемых клетками факторов роста и цитокинов [17,18,26,52,53,61,62].

В связи с этим целью наших исследований было изучение рецепторного аппарата и цитокиновой продукции некоммитированных и коммитированных по остеогенному пути МСК как факторов, реализующих влияние МСК на процессы репаративного остеогенеза.

Материал и методы

В экспериментах in vitro при помощи иммуннофенотипирования изучали модификацию рецепторного аппарата и, используя иммуноферментный метод BD OptEIA Human ELISA, определяли продукцию цитокинов некоммитированными и коммитированными по остеогенному типу МСК. В исследованиях использовали МКА, которые рекомендованы для специфического маркирования поверхностных антигенов 8-ым Международным рабочим совещанием по вопросам лейкоцитарных антигенов дифференцирования человека (The 8th International HLDA Workshop and Conference, Adelaide, Australia, 2004). Все МКА и изотип-контроли были производства фирмы BD Biosciences (США). Определение концентрации цитокинов в супернатантах культивированных МСК проводили при помощи иммуноферментного метода BD OptEIA™ Human ELISA (производства – BD Biosciences, США), которые предназначены для количественного определения цитокинов человека в сыворотке, плазме и в супернатанте (кондицированной среде) клеточных культур. Использовали наборы для определения следующих цитокинов: human ІL-1β ELISA Kit II; human ІL-2 ELISA Kit II; human ІL-4 ELISA Kit II; human ІL-6 ELISA Kit II; human ІL-8 ELISA Kit II; human TNF ELISA Kit II. Маркирование некоммитированных и остеоиндуцированых МСК на поверхностные антигены осуществляли в культурах 1-4-го пассажей от 14 линий, а концентрацию ЦК в супернатантах на 1-е, 3-и и 5-е сут. для неиндуцированных МСК и на 10-е, 13-е, 16-е и 19-е сутки для индуцированных клеток.

Результаты и обсуждение

Фенотип (рецепторный аппарат) некоммитированных и коммитированных по остеогенному пути МСК костного мозга. В связи с тем что в процессе исследований было использовано значительное количество маркеров, полученные данные, для упрощения их анализа, были сгруппированы по антигенам, обладающим подобными функциями: а) адгезивные молекулы межклеточного взаимодействия; б) молекулы адгезии к эндотелиальным клетками и адгезивные молекулы эндотелиоцитов; в) молекулы, обеспечивающие адгезию к внеклеточному матриксу (ВКМ); г) молекулы, ответственные за активацию и костимуляцию иммуннокомпетентных клеток; д) молекулы, определяющие основной комплекс гистосовместимости (Major Hіstocompatіbіlіty Complex (МНС)). Данные исследований представлены в таблице 1.

Среди группы рецепторов-молекул клеточ­ной адгезии, которые определяют межклеточ­ные взаимодействия в системе «активирован­ный/неактивированный эндотелий – клетка», позитивная экспрессия на поверхности МСК была получена для L-селектина – CD62L. Уро­вень экспрессии в обеих группах клеток был не­значительным (до 40 %) и не имел статистиче­ски значимых различий.

В группе маркеров, сформированных на ос­нове их возможности принимать участие в про­цессах прямой и опосредованной активации иммуннокомпетентных клеток и других клеточ­ных популяций (антигены активации и кости­муляции), отмечалась незначительная экспрес­сия LFA-3 (СD58). Данный антиген экспресси­ровался как некоммитированными, так и ком­митироваными МСК.

Из антигенов молекул, которые вовлекаются в межклеточную и клеточно-матриксную адге­зию, на клетках культур обеих групп МСК экс­прессировались β1(СD29), α2 (СD49b) и α3 (СD49с) субъединицы интегринов. Сформиро­ванные ими рецепторы позволяют клеткам при­соединяться к молекулам внеклеточного мат­рикса, таким как фибронектин, ламинин и кол­лаген. Интегрин β1 был представлен на боль­шинстве клеток культур, а в группе коммитиро­ванных МСК 3-4 пассажей наблюдалось досто­верное увеличение его экспрессии (p<0,05). Субъединицы интегринов α2 и α3 также отчет­ливо визуализировались на клеточной мембране приблизительно в одинаковом балльном интер­вале (около 60% СD-позитивных клеток культур в обеих группах МСК). На основании рангового анализа экспрессия интегриновых субъединиц (β1, α2 и α3) может считаться стабильной в те­чение всего периода культивирования. В связи с тем что комбинации β1- и разных α-цепочек формируют рецепторы к компонентам экстра­целлюлярного матрикса (α2β1-ламинин, колла­ген и α3β1-ламинин, коллаген, фибронектин), то полученные данные позволяют говорить о на­личии на МСК полноценных рецепторов к большинству компонентов соединительной ткани. Экспрессия интегриновой α1-цепочки, субъединицы коллагенового рецептора полно­стью отсутствовала на обеих группах МСК.

При выявлении на поверхности культивиро­ванных МСК антигенов Мнс-комплекса было установлено, что в процессе культивирования моноклональные антитела практически не выяв­ляют молекулы I класса – HLA-A,B,C и ІІ класса – HLA-DR. Незначительный уровень экспрессии HLA-DR отмечался в культурах коммитирован­ных МСК. Известно, что МСК экспрессируют поверхностные молекулы ІІ класса HLA-DR только при стимуляции их γ-интерфероном. От­сутствие экспрессии данного класса МНС явля­ется одним из критериев, идентифицирующих МСК в нестимулированном состоянии [54].

Основываясь на представленных выше ре­зультатах исследований, некоммитированные культивированные МСК, в соответствии с ис­пользованной панелью маркеров, имеют сле­дующий рецепторный аппарат (фенотип): СD44high/СD166high/СD58+/CD62L+/CD29+/CD49b+/CD49c+/CD54+/CD56+,а культивированные коммитированные по остеогенному пути МСК

СD44high/СD166high/СD58+/CD62L+/CD29+/CD49b+/CD49c+/CD54+/CD56-/lo/ HLA-DR-/lo.

Цитокиновая продукция некоммитирован­ными и коммитированными культурами МСК костного мозга. Данные, полученные в резуль­тате изучения продукции цитокинов некомми­тированными и коммитироваными МСК, пред­ставлены в таблице 2. Для оценки активности цитокиновой продукции некоммитированными и коммитированными МСК в таблицу были включены данные о цитокиновой продукции нестимулированными клеточными культурами мононуклеаров периферической крови (МН ПК) здоровых доноров, которые были получены в результате мета-анализа зарубежных исследова­ний [29-34].

Из представленных в таблице 2 данных видно, что некоммитированные и коммитированные МСК секретируют ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α. Хотелось бы подчеркнуть, что продукция ИЛ-1β и ИЛ-2 культивированными МСК нами была выявлена впервые. Для анализа динамики секреции ЦК МСК в процессе их пролиффереции (некоммитированные МСК) и дифференцировки (коммитированные по остеогенному пути МСК) цифровой материал таблицы 2 был представлен в виде графиков с их аппроксимацией и определением величины достоверности аппроксимации R2 (рис. 1).

Из представленных на рисунке 1 графиков видно, что в процессе коммитации МСК отмечалось достоверное увеличение секреции ИЛ-2 (R2»0,63), ИЛ-6 (R2»0,76) и ИЛ-8 (R2»0,62) по сравнению с некоммитированными клетками. Продукция ИЛ-4 и ФНП-α как некоммитироваными, так и коммитироваными МСК оставалась практически на одном уровне (R2»0,015 и R2»0,091 соответственно), а продукция ИЛ-1β имела отчетливую тенденцию к увеличению (R2»0,42). Рост уровня секреции ИЛ-6 и ИЛ-8 культивированными МСК, особенно коммитированными по остеогенному типу, в нашем исследовании выявлен впервые.

При сравнении цитокиновой продукции МСК с МН ПК (см. табл. 2) было отмечено, что продукция ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α некоммитированными и коммитированными МСК в процессе культивирования достоверно отличалась от таковой у МН ПК (p<0,05) за исключением продукции ИЛ-1β, ИЛ-8 и ФНО-α в течение первых суток культивирования, когда их концентрация не отличалась от цитокиновой продукции МН ПК. Секреция МСК ИЛ-2 была достоверно ниже (p<0,05) только в первые сутки культивирования. В течение последующего времени культивирования достоверного различия между секрецией ИЛ-2 МСК и МН ПК отмечено не было.

Таким образом, некоммитированные и коммитированные по остеогенному пути МСК в условиях культуры активно продуцируют про- и противовоспалительные ЦК – ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНП-α и ИЛ-4 соответственно. Впервые выявлена секреция ИЛ-1β и ИЛ-2 культивированными МСК, а также впервые было выявлено увеличениt уровня секреции ИЛ-6 и ИЛ-8 культивированными МСК, в частности в коммитированной группе. Полученные в результате исследований данные о модификации поверхностных рецепторов и цитокиновой продукции у некоммитированных и коммитированных МСК позволяют определить функциональные возможности этих клеток и механизмы их влияния на процессы репаративного остеогенеза.

Наиболее выраженная экспрессия мембранных антигенов на поверхности как некоммитированных, так и коммитированных МСК человека наблюдалось у СD44 и СD166.

В зависимости от клеточной популяции CD44 может выполнять различные функции, основными из которых являются клеточная адгезия, хоуминг клеток в периферические лимфоидные органы и очаги воспаления, клеточная активация и увеличение продукции цитокинов и факторов роста. В экспериментах было показано, что при повреждении тканей для формирования грануляционной ткани необходима миграция фибробластов в рану, которая обеспечивается активацией интегриновых рецепторов и протеогликановым комплексом, образующийся за счет дерматан-, хондроитин-сульфата и изоформы СD44Н [24]. В исследованиях H.N.Lovvorn at al. было показано, что заживление постнатальных покровных тканей с высоким уровнем экспрессии CD44 происходит без формирования рубца [35].

Основной функцией CD166, наиболее детально изученной на сегодняшний день, является активация клеток иммунной системы и инициация межклеточных взаимодействий, в том числе взаимодействие эпителиальных клеток с лимфоцитами [22, 65].

В отличие от CD44, у которого уровень активности отмечался очень высоким как у некоммитированных, так и у коммитированных МСК, у СD166 он увеличивался с высокого у некоммитированых клеток до очень высокого у коммитированных. Последнее, возможно, связано с тем, что клетки иммунной системы играют важную роль при формировании остеоидной ткани [1, 6, 7]. Повышение уровня активности данного кластера при дифференцировке МСК по остеогенному пути обеспечивает необходимую активацию клеток иммунной системы.

CD56 является биологически важной молекулой для функционирования остеобластов и МСК. Этот рецептор принимает активное участвует в литических процессах в костной ткани [20]. В ряде исследований было показано, что NCAM (антиген к CD56) активно экспрессируется остеобластами, клетками периоста и МСК в зонах активного формирования кости, при этом он не экспрессируется остеоцитами [23]. Поэтому активность экспрессии CD56 достоверно (p<0,05) снижается в процессе остеогенной дифференцировки МСК.

Основной функцией CD54 является активация Т-, В-лимфоцитов, моноцитов и эндотелиальных клеток [28,59,70]. В процессе пролиферации МСК экспрессия этого кластера была на стабильно среднем уровне. Однако уже в начале процесса дифференцировки происходило достоверное увеличение уровня его экспрессии (p<0,05), что, возможно, связано с тем, что данный антиген вовлекается в процессы васкуляризации и вовлечения предшественников остеокластов – моноцитов – в область резорбции костной ткани при заживлении костной раны. Также CD54 выполняет определенную иммуннорегуляторную функцию в стадии воспаления остеорепаративного процесса. СD62L, активность которого была значительной в двух группах МСК, действует как хоуминговый рецептор для лейкоцитов и способствует их адгезии к активированному эндотелию венул [55].

CD58, известный как один из основных антигенов, которые определяют функциональную активность лимфоцитов (LFA-3), обеспечивает костимуляционный сигнал в иммунном ответе, активирует киллерные клетки и обеспечивает их адгезию к клеткам-мишеням [21,47]. Также экспрессия CD58 на клеточной поверхности определяет роль данной клетки в межклеточных взаимодействиях при воспалительном процессе [64]. Миграция и активация тромбоцитов, инвазия фибробластов, лимфоидных и эпителиальных клеток в процессе заживления раны осуществляется путем интегриново-матриксных взаимодействий [13,15]. Экспрессия различных цепочек интегринов на МСК свидетельствует о том, что эти клетки принимают активное участие в репаративных процессах.

Недавно было показано, что протеины внеклеточного матрикса кости – коллаген I типа и витронектин – индуцируют остеогенную дифференциацию. Это свидетельствует в пользу того, что протеины костного матрикса и связанные с ними интегриновые рецепторы, в том числе CD29, участвуют в остеогенной дифференциации МСК [63] CD 49b (α2β1-інтегрин), являясь рецептором к коллагену и ламинину, регулируют экспрессию коллагена І типа и коллагеназы-3, которая необходима для клеточной миграции на коллагене [40]. Одной из функций ламининового (ЛН-5) рецептора (CD 49с, α3β1) является активация остеогенных генов с помощью транскрипционого фактора Runx2/CBFA-1 [10,45]. Значительная активность экспрессии различных цепочек интегринов как на некоммитированных, так и коммитированых МСК свидетельствует в пользу готовности культивированных популяций МСК к активному остеогенезу при их трансплантации.

Таким образом, модификация рецепторного аппарата МСК в процессе пролиферации и дифференцировки создает микроокружение, которое активизирует клетки иммунной системы, эндотелиоциты, преостеокласты, тромбоциты, фибробласты и остеогенные транскрипционные факторы. В зависимости от клеточной стадии, в которой находятся МСК (пролиферации или дифференцировки), активность ряда рецепторов клеточной мембраны изменяется. В стадии пролиферации активность экспрессии CD56 и CD58 выше, чем в стадии дифференцировки и, наоборот, в стадии дифференцировки возрастает активность CD166, CD54, CD62L и CD29, что позволяет создать условия для формирования из МСК костной ткани de novo.

Являясь одним из основных регуляторов иммунного и воспалительного ответа, интерлейкин 1β действует практически на все типы клеток. Основными свойствами ИЛ-1 являются активация: продукции антител В-лимфоцитами; выработки разными клетками факторов колонизации (гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), макрофагального колониестимулирующего фактора (М-КСФ); образования нейтрофилов и моноцитов; резорбция и перестройка кости; пролиферация фибробластов и синовиоцитов. Влияя на эндотелий, ИЛ-1 увеличивает его проницаемость, индуцирует его прокоагуляционную активность, стимулирует выделение фактора активации тромбоцитов (PAF), а также усиливает прилипание лимфоцитов и нейтрофилов к эндотелиоцитам [19]. В экспериментах in vitro было показано, что ИЛ-1 обладает супрессивным эффектом на хондрогенез и матриксные протеины кости КМБ-2 и КМБ-9 [50]. Также ИЛ-1 способствует увеличению экспрессии генов матрикс-разрушающих энзимов (ММП-3 и 13), снижению экспрессии матриксных генов коллагена І и ІІ типа [46] и индуцирует резорбцию костной ткани за счет стимуляции продукции остеокластоподобных многоядерных клеток и увеличения остеолитической активности остеокластов [11]. Достоверное увеличение продукции ІЛ-1β МСК в процессе их пролиферации и дифференцировки свидетельствует о том, что МСК посредством продукции этого цитокина способствуют развитию в области трансплантации воспалительного процесса и активизации процессов остеорезорбции. Наличие отчетливой тенденции к увеличению секреции ИЛ-1β в процессе пролиферации и дифференцировки, вероятно, направлено на привлечение в зону трансплантации преостеокластов – моноцитарных клеток, наличие которых, согласно теории сопряжения функции остеокластов и остеобластов (взаимного потенцирования дифференцировки и активации друг друга), необходимо для формирования костной ткани [3, 4]. Действие интерлейкина 2 на находящиеся в покое клетки проявляется в активации их пролиферации, что определяет его как типичный фактор роста клеток лимфо-миелоидного ряда и негемопоэтических клеток [69]. Мишенями регуляторного воздействия ИЛ-2 являются различные субпопуляции Т- и В-клеток, натуральные киллерные клетки и макрофаги [9]. Основными процессами, которые стимулирует этот ЦК, являются: пролиферация и дифференциация Т- и В-лимфоцитов, активация и пролиферация натуральных киллерных клеток и макрофагов и усиление синтеза иммуноглобулинов и интерферона [69].

В процессе пролиферции и дифференцировки МСК секреция ИЛ-2 достоверно возрастала, что свидетельствует о регуляторном влиянии МСК на клеточный и гуморальный иммунитет, играющий важную роль в остеорепаративных процессах [1,2,8]. Интерлейкин-4 принимает участие в развитии костномозговых клеток-предшественников [41], стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов и фибробластов, участвует в дифференцировке В-лимфоцитов, тормозит выделение моноцитами и макрофагами провоспалительных ЦК – ТФР-α и ИЛ-1 [41,49], играет важную роль в регуляции гомеостаза костной ткани, угнетая RANKL-индуцированную костную резорбцию и активность зрелых остеокластов человека [51]. Секреция ИЛ-4 МСК в процессе пролиферации и дифференцировки достоверно не менялась, отмечались периоды его достоверного увеличения, что, вероятно, связано с увеличением пролиферативной активности клеток и их дифференцировкой.

Интерлейкин-6 является одним из основных факторов регуляции защитных механизмов и принимает участие в иммунном ответе, воспалительной реакции и гемопоэзе. Он индуцирует B-клеточное дифференцирование, стимулирует секрецию IgG, усиливает пролиферацию коммитированных предшественников гранулоцитарной и макрофагальной клеточных линий, стимулирует клетки-предшественники костного мозга и стимулирует резорбцию кости остеокластами [42, 36-39]. Достоверная динамика увеличения секреции ИЛ-6, вероятно, обусловлена тем, что в процессе дифференцировки в остеобласты МСК посредством продукции ИЛ-6 регулируют процессы подготовки резорбционной лакуны к прикреплению остеобласта. Интерлейкин-8 продуцируется мононуклеарными фагоцитами, полиморфно-ядерными лейкоцитами, эндотелиальными клетками, макрофагами, лимфоцитами, эпителиальными клетками, фибробластими, клетками эпидермиса [37,66]. Обладая выраженными провоспалительными свойствами, он выступает как хемоаттрактант для нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов, эозинофилов и способствует их адгезии. Эти свойства определяют его как активного участника острой воспалительной реакции в области патологического процесса [12,37,67].