Журнал «Травма» Том 9, №2, 2008

Основной функцией остеобласта является его участие в физиологической и репаративной регенерации костной ткани – остеогенезе. Последний характеризируется вовлечением и пролиферацией остеопрогениторных клеток. Клеточными источниками, обеспечивающими процессы остеогенеза, являются активно пролиферирующие малодифференцированные клетки-предшественники. К ним относятся мезенхимальные (стромальные) стволовые клетки (МСК), локализованные в строме костного мозга и экстраскелетных кроветворных органах [20], остеогенные клетки внутреннего слоя периоста, клеточные элементы каналов остеонов и эндоста и периваскулярные клетки [2-4]. Эти клетки после остановки клеточного размножения дифференцируются в функционирующие остеобласты/остеоциты, ответственные за синтез и минерализацию костного матрикса. Зрелые остеобласты характеризуются определенными маркерами дифференциации, такими как щелочная фосфатаза (ЩФ), коллаген I типа, остеопонтин (ОП), трансформирующий фактор роста бета (TGFβ), фибронектин, остеокальцин и костный сиалопротеин [23].

Любой раневой (репаративный) процесс претерпевает ряд классических стадий, представляющих собой серию комплексных событий, таких как хемотаксис, митоз, васкуляризация, синтез компонентов экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) и его организация [11]. При остеорепаративных процессах, наряду с вышеперечисленными стадиями, принято выделять стадию формирования и реорганизации костного регенерата [6, 8, 9]. Контроль большинства событий, развивающихся в течение раневого процесса, осуществляется посредством растворимых медиаторов (ростовые факторы, цитокины, матриксные металлопротеиназы и др.), которые оказывают влияние на различные клеточные типы [11, 13, 16]. При остеорепаративных процессах воздействие этих медиаторов направлено на МСК, остеобласты, эндотелиоциты, клетки лимфоидного и миелоидного ростков, а также клетки моноцитарно-макрофагального ряда. В костной ране остеорепаративные процессы запускаются повреждающим фактором (механическое воздействие, некротизация участков костной ткани), который приводит к разрушению клеточных мембран и запуску четырех перекрывающихся, но четко определенных фаз – гемостаза, воспаления, пролиферации и ремоделирования [6].

В последнее время в зарубежной литературе начали появляться единичные работы, посвященные изучению цитокинового профиля, продуцируемого МСК и остеобластоподобными клетками [29]. Все больший интерес исследователи стали проявлять к пониманию возможных механизмов цитокиновой регуляции процессов физиологической и репаративной регенерации костной ткани. Недавно было показано, что антигенный фенотип остеобластоподобных клеток, их способность фагоцитировать частицы различной природы и размеров и их способность стимулировать аллогенные Т-клетки свидетельствует о наличии взаимодействий между остеобластоподобными клетками и клетками других популяций, с которыми они могут разделять некоторые общие иммунные функции. Свою иммунорегуляторную функцию остеобластоподобные клетки могут реализовывать через экспрессируемые ими ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18 и γ-интерферон [29]. В литературе имеются данные о том, что остеобласты можно отнести в функциональном плане к фолликулярным дендритическим клеткам на основании общности поверхностных антигенов обеих популяций [29]. Изучение роли МСК как потенциально активных индукторов иммунорегуляции репаративных процессов в костной ране является весьма актуальным и имеет немаловажное теоретическое и практическое значение для дальнейшего изучения остеорепарации и оптимизации технологий трансплантации МСК. К тому же первичные клинические исследования показали, что трансплантация культивированных некоммитированных МСК пациентам с длительно несрастающимися переломами костей нижних конечностей оказалась весьма эффективной, дала хорошие результаты [5] и в то же время вскрыла ряд проблем, поиску решений которых посвящена данная работа.

Целью настоящих исследований являлось определение функционального статуса некоммитированных и остеоиндуцированных МСК посредством изучения количественной продукции цитокинов следующего профиля: ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α (фактор некроза опухолей альфа).

Материал и методы

МСК изолировали по общепринятой методике [24] из аспирата костного мозга, забранного на гепарине, при пунктировании грудины или гребня подвздошной кости у пациентов травматологического профиля. Среднее количество аспирата составляло 20 мл от одного больного. Мононуклеарную фракцию аспирата высевали на проколлагененные пластиковые флаконы площадью 75 см2 (Corning, США) и культивировали в ростовой среде DMEM/F12 (Sigma, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия) и 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов (Sigma, США) в СО2-инкубаторе (Jouan, Франция) при температуре 37°С в атмосфере с 5% содержанием СО2. При пассировании культур использовали 0,25% раствор трипсина и ЭДТА (Биолот, Россия) в соотношении 1:5. Остеоиндукцию линий МСК осуществляли путем внесения в выше указанную ростовую среду остеогенной добавки: 0,1 μМ дексаметазона, 10 мМ β-глицерофосфата и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma, США).

Мета-аналитические данные по интерлейкиновой продукции были взяты из исследований, проведенных на культурах мононуклеаров периферической крови (МН ПК) здоровых доноров. МН ПК – это гетерогенные популяции одноядерных клеток, мигрирующих в циркуляторное русло из костного мозга. Они включают как субстрат-независимые ранние популяции гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), так и адгерентные к пластику мало дифференцированные популяции МСК [17, 30].

Окраску культур на щелочную фосфатазу проводили иммуноцитохимическим методом с применением субстрата BCIP/NBT Liquid Substrate System (Sigma, США) согласно инструкции.

Количественное определение цитокинов в клеточных супернатантах проводили с помощью метода твердофазного сэндвича - BD OptEIA Human ELISA (производитель - BD Biosciences, США). Измерения проводились по оптической плотности полученного раствора с использованием фотометра для многофункционального анализа Synergy HT Bio-Tek Instruments и программы КС4 System (США).

Измерение концентрации цитокинов в культурах осуществляли согласно схемы: некоммитированные МСК 1-2 пассажей – сбор супернатанта производили на первые (n=30), третьи (n=30) и пятые (n=30) сутки; остеоиндуцированные МСК 1-2 пассажей – на десятые (n=30), тринадцатые (n=30), шестнадцатые (n=30) и девятнадцатые (n=30) сутки культивирования.

Визуализацию и фотодокументирование культур производили посредством инвертированного микроскопа Leica DMIL, рабочей станции по обработке изображений Leica QWin500 Standart и видеокамеры Sanyo TK-C1380 (Германия).

Полученные данные были выражены как среднее значение со стандартной ошибкой среднего и статистически проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

На рисунке 1 представлены графики, отражающие динамику изменения концентрации цитокинов в супернатантах некоммитированных культур МСК.

Из графиков видно, что максимальная концентрация цитокинов обнаруживалась в супернатантах некоммитированных культур, собранных после трех суток культивирования: ИЛ-1β – 56,21 пг/мл, ИЛ-2 – 14,92 пг/мл, ИЛ-4 – 32,56 пг/мл, ИЛ-6 – 112,52 пг/мл, ИЛ-8 – 386,11 пг/мл и ФНО-α – 17,74 пг/мл. Концентрации цитокинов из суточного супернатанта еще не достигали значений трехсуточного, а кондиционированная среда, не сливаемая с культур в течение 5 суток культивирования, уже показывала снижение концентраций во всем цитокиновом спектре некоммитированных МСК. Уровень секреции цитокинов некоммитированными МСК нами был принят за базовый при данных условиях культивирования.

Определение концентрации цитокинов в супернатантах культур остеоиндуцированных МСК осуществляли в трехсуточных сливах на 10-е, 13-е, 16-е и 19-е сутки индукции (рис. 2). Выбор данных сроков был обусловлен особенностями технологии остеоиндукции МСК.

Как видно из графиков на рисунке 2, четкой линейной зависимости в уменьшении или увеличении секреции цитокинов МСК в зависимости от суток культивирования не наблюдалось. Однако при аппроксимации и сглаживании полученных кривых можно выявить тенденцию в цитокиновой продукции. Так, для ИЛ-1β, ИЛ-2 и ИЛ-4 (рис. 2 а-в) наблюдалась тенденция к увеличению секреции с 10-х по 19-е сутки индукции, а для ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α – к снижению (рис. 2 г-е).

На рисунке 3 приведена сравнительная диаграмма среднего уровня секреции цитокинов некоммитированными (1-5-е сутки культивирования) и коммитированными (10-19-е сутки остеогенной индукции) линиями МСК. В качестве третьего столбца приведены значения концентраций цитокинов, измеренных в нестимулированных клеточных культурах мононуклеаров периферической крови здоровых доноров (согласно данным мета-анализа зарубежных исследований).

Представленные данные свидетельствуют о том, что уровень ИЛ-6 (101,3 пг/мл – некоммитированные МСК и 276,5 пг/мл – остеоиндуцированные МСК) и ИЛ-8 (261,6 пг/мл и 106,6 нг/мл соответственно) в обеих группах значительно выше, чем всех остальных измеряемых цитокинов, и цитокинов группы МН ПК. Продукция ИЛ-6 остеоиндуцированными линиями в 2,7 раза больше, чем некоммитированными, и почти в 7 раз выше, чем в культурах МН ПК здоровых доноров.

Но секреция ИЛ-6 некоммитированными МСК также больше, чем в группе МН ПК, в 2,5 раза. Подобным образом, продукция ИЛ-8 коммитированными линиями в 4 раза больше, чем некоммитированными, и почти что в 6 раз выше, чем в культурах МН ПК здоровых доноров. Секреция ИЛ-8 некоммитированными МСК также больше, чем в группе МН ПК, в 1,5 раза.

Уровень провоспалительного ИЛ-1β, как видно из диаграммы, также выше в коммитированной группе (47,8 пг/мл). Его продукция остеоиндуцированными линиями в 1,5 раза больше, чем некоммитированными (32,7 пг/мл), и в 2,7 раз выше, чем в культурах МН ПК здоровых доноров. Секреция ИЛ-1β некоммитированными МСК также больше, чем в группе МН ПК, почти в 2 раза.

По уровню секреции остальных цитокинов значительных различий не получено. Но сам факт секреции обеими группами МСК такого широкого цитокинового профайла уже сам по себе примечателен. Единственно, концентрация противовоспалительного ИЛ-4 значительно ниже в супернатантах некоммитированных (16,9 пг/мл) и коммитированных (14,4 пг/мл) культур, чем в группе МН ПК здоровых доноров. Более того, секреция МСК ИЛ-1β (в отличие от ИЛ-1α) и ИЛ-2 впервые показана в настоящих исследованиях. В зарубежной литературе данные по их секреции остеобластами или МСК отсутствуют.

Как указывалось выше, понимание иммунорегуляторных механизмов воздействия культивированных МСК на процессы остеорепарции имеет важное теоретическое и клиническое значение.

Известно, что биологической сущностью воспалительной реакции, развивающейся в ответ на травму, является создание условий для немедленной элиминации некротизированных клеток и создания условий для собственно репаративных процессов. Поэтому в начале первой стадии посттравматической регенерации все регуляторные процессы направлены на развитие воспаления в очаге повреждения. В связи с тем, что скорость репарации кости зависит от интенсивности деструкции поврежденных клеток и высвобождения остеоиндуктивных факторов, на заживление костной раны значительное влияние оказывает соотношение между индуктивными и ингибирующими факторами, которые выделяются из поврежденных клеток и синтезируются жизнеспособными клетками. В течение следующей фазы, собственно репарации, иммунорегуляторные процессы направлены на создание условий для восстановления целостности костной ткани, что сопряжено с процессами пролиферации и последующей дифференцировки клеточных источников остеорепарации [21]. Исходя из этого, нами был проведен анализ полученных результатов.

Цитокиновая регуляция процессов воспаления и костной перестройки

Согласно данным наших исследований, основными провоспалительными цитокинами, которые МСК могут секретировать в рану, являются ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8. Эти же цитокины являются ключевыми и в процессах, регулирующих метаболизм и перестройку костной ткани [28, 32]. В течение первой стадии остеорепарации ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8 привлекают в очаг повреждения нейтрофилы и моноциты/макрофаги и усиливают их адгезию к клеткам эндотелия в очаге повреждения, чем создают условия для гуморально-клеточной кооперации крови и костной ткани и развития воспалительной реакции [10, 15]. Макрофаги, в свою очередь, активируются напрямую посредством лиганд-рецепторного взаимодействия (IL-6R/IL-6) и дифференцируются в зрелые остеокластные поликарионы, способные резорбировать костную ткань [27, 28]. Кроме того, ФНО-α и ИЛ-1β аутокринно регулируют процессы пролиферации/дифференциации МСК/остеобластов в ране [27]. Последние, в ответ на аутокринный стимул, начинают вырабатывать коллагеназы и протеазы, которые также принимают участие в резорбции некротизированных участков кости. Вдобавок оба этих интерлейкина стимулируют выработку остеобластами ИЛ-6 и ИЛ-8 [32].

Согласно нашим исследованиям, продукция ИЛ-6 и ИЛ-8 МСК многократно повышается как в процессе пролиферации, так и в процессе дифференцировки (см. рис 3). Это повышение обусловлено как паракринным, так и аутокринным воздействием ФНО-α и ИЛ-1β на МСК. Кроме того, ФНО-α также по аутокринному механизму, стимулирует остеобласты к выработке RANKL лиганда, который является ключевым участником гетерофильного межклеточного взаимодействия «остеобласт-предшественник остеокласта» (RANKL/ RANK соответственно) [25, 31]. Именно такое взаимодействие способствует созреванию остеокласта и продукции им всего арсенала матриксных белков и матриксных металлопротеаз, участвующих в процессах остеолиза костной ткани [27]. ФНО-α и ИЛ-1β также способствуют хемотаксису эндотелиоцитов в место воспаления, что в свою очередь приводит к инициации ангиогенеза в месте повреждения [19]. Это свидетельствует о том, что МСК через продуцируемых ими ФНО-α и ИЛ-1β способствуют процессам восстановления кровообращения в очаге повреждения, а также, возможно, за счет формирования микроокружения с привлеченными в очаг повреждения эндотелиоцитами, дифференцируются в ангиогенном направлении.

Противовоспалительный ИЛ-4 за счет подавления секреции предшественниками остеокластов агентов воспаления ФНО-α и ИЛ-1β оказывает ингибирующее влияние на процессы костной резорбции и миграции остеокластов [22, 29]. Но продукция ИЛ-4 МСК в обеих группах по сравнению с отдельной и суммарной секрецией всех остальных изученных нами провоспалительных цитокинов незначительна.

Функциональная кооперация МСК/остеобластов и лимфоцитов посредством цитокинов

ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8 также вносят свой вклад в процессы кооперации лимфоцитов и МСК как предшественников остеобластов. Так, ИЛ-1β, воздействуя на эндотелий, увеличивает его проницаемость для клеток крови и способствует притоку последних в очаг воспаления и раневого заживления. Он же способствует дегрануляции тучных клеток, что ведет к повышению проницаемости сосудистой стенки и привлечению в зону травмы клеток белой крови, прежде всего лимфоцитов и моноцитов, обеспечивающих течение воспалительного процесса [34]. ИЛ-8 усиливает хемотаксис лейкоцитов в очаг воспаления [14], а ИЛ-6 стимулирует пролиферацию клеток гранулоцитарного и макрофагального ряда, дифференциацию В-клеток и созревание мегакариоцитов [26]. ФНО-α и ИЛ-1β оказывают стимулирующее воздействие на пролиферацию/дифференциацию лимфоидного ростка ГСК. Вследствие этих процессов концентрация В-, Т-лимфоцитов и моноцитов в очаге повреждения/воспаления повышается, что ведет к активация тимуса и паратиреоидной системы – системных факторов регуляции остеорепарации [7]. Наряду с регуляцией системных факторов остеорепарации МСК через увеличение количества В-, Т-лимфоцитов и моноцитов оказывает воздействие и на местные регуляторные факторы воспалительной фазы репаративного остеогенеза [1].

В наших исследованиях впервые был отмечен факт секреции обеими группами МСК ИЛ-2. Основным результатом действия ИЛ-2 на покоящиеся или стимулированные антигеном или митогеном иммунокомпетентные клетки является обеспечение их пролиферации. Именно эта биологическая активность ИЛ-2 определяет его в качестве типичного ростового фактора клеток лимфо-миелоидного ряда [35]. Мишенями регуляторного действия ИЛ-2 являются различные субпопуляции Т-клеток, В-клетки, натуральные киллерные клетки, макрофаги. Все они имеют соответствующий рецептор для восприятия сигнала от ИЛ-2 [12, 33]. Перечисленные эффекты ИЛ-2 на иммунокомпетентные клетки свидетельствуют о возможном участии МСК в процессах иммунного ответа и активации В- и Т-лимфоцитов, стимуляции пролиферации лимфоидных и миелоидных линий ГСК, а также активации звена неспецифического иммунитета в виде пролиферации предшественников нейтрофилов, натуральных киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов. Эти клеточные популяции привлекаются в очаг повреждения и под воздействием ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-8 [27], которые также секретируются МСК.

ИЛ-4 стимулирует секрецию Т-клетками ИЛ-2 и активирует экспрессию В-клетками молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов [27]. Также этот противовоспалительный цитокин регулирует синтез ИЛ-6, ИЛ-8 и LIF (leukemia inhibitory factor) человеческими МСК [18]. При кооперации данного цитокина с ИЛ-1 происходит стимуляция пролиферации мегакариоцитарного ростка; с эритропоэтином – эритроидного ростка; с гранулоцит-колониестимулирующим фактором – моноцитарного и гранулоцитарного ростков [22].

Выводы

Обобщая изложенный в данной работе материал, можно говорить о том, что МСК в процессе пролиферации и ранней дифференцировки продуцируют преимущественно провоспалительные интерлейкины ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8, которые регулируют развитие воспалительных процессов в очаге повреждения, привлечение костных макрофагов (остеокластов), резорбцию некротизированных участков костной ткани. Это способствует созданию условий для прикрепления МСК/остеобластов к жизнеспособной костной ткани и формированию остеонов. Продукция МСК противовоспальтельного ИЛ-4, вероятнее всего, выполняет сдерживающую регуляторную функцию, которая направлена на ингибирование воспалительных и остеорезорбирующих процессов. Соотношение провоспалительных и противовоспалительных цитокинов на ранних этапах дифференцировки МСК смещается в сторону превалирования провоспалительных цитокинов. Возможно, что в процессе дальнейшей (поздней) дифференцировки МСК в остеобласты соотношение провоспалительных и противовоспалительных цитокинов будет смещаться в сторону увеличения противовоспалительных факторов. Помимо участия МСК в иммунорегуляции воспалительных процессов посредством секреции ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8, эти клетки способствуют функциональной кооперации МСК/остеобластов и лимфоцитов, а посредством секреции ИЛ-2 и ИЛ-4 МСК активируют В- и Т-лимфоциты и стимулируют пролиферацию лимфоидных и миелоидных линий ГСК.

Таким образом, МСК посредством поверхностной экспрессии различных функциональных молекул и цитокиновой продукции могут являться мощными и эффективными активаторами костной резорбции, воспаления и иммунного ответа в процессе посттравматической остеорепарации костной ткани, особенно в тех случаях, когда последний имеет тенденцию к хронизации и «замирает» в воспалительной или пролиферативной фазе.