Журнал «Медицина неотложных состояний» 6 (37) 2011

Критические состояния, включая травму и сепсис, часто осложняются развитием полиорганной недостаточности и связаны с гибелью клеток паренхиматозных и непаренхиматозных тканей. Множество исследований посвящено роли апоптоза в развитии иммунной и органной дисфункции, наблюдаемой при сепсисе и шоке. Апоптотическим изменениям подвергаются нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, а также различные популяции лимфоцитов, эндотелиальные и эпителиальные клетки. Клинические и экспериментальные наблюдения позволяют предположить, что «программированная гибель» клеток путем апоптоза может играть важную роль в механизмах полиорганной недостаточности (ПОН) у пациентов в критических состояниях [1–3]. В ранний период сочетанной травмы, осложненной шоком, апоптоз индуцируется в тимусе, селезенке, печени, легких и кишечнике, при этом процент фрагментированной ДНК в этих органах возрастает в соответствии с тяжестью травмы [3]. Исследование методом ISEL показало развитие апоптоза также в мозге, сердце и почках [4, 5]. В головном мозге после геморрагического шока наблюдалось нарастание апоптоза в течение первых суток после ишемии-реперфузии [6]. Ишемия кишечника после травмы и геморрагического шока приводит к дисфункции кишечного барьера и продукции-высвобождению биологически активных и повреждающих ткани факторов в мезентериальную лимфу, что, в свою очередь, вызывает острую легочную недостаточность и развитие системного воспалительного ответа. Предполагается, что повреждение легких при травме с геморрагическим шоком связано с апоптозом эндотелиальных и эпителиальных клеток легких. Есть мнение, что апоптоз в легких протекает по Fas-опосредованному механизму [2, 6, 7].

Цель исследования: определение динамики сывороточных маркеров апоптоза при благоприятном прогнозе сочетанной травмы.

Материалы и методы

В исследование были включены 34 пострадавших с сочетанной травмой. Исключены пострадавшие с превалированием тяжелой черепно-мозговой травмы (ЧМТ); сопутствующей тяжелой соматической патологией, известной на момент включения; умершие в первые сутки от необратимого шока. Исследование одобрено Этическим комитетом учреждений. Тяжесть пострадавших по шкале ISS — 35,0 ± 14,0 балла (Champion et al., 1991), что соответствует вероятности летального исхода по TRISS 9,5 %; по шкале APACHE II — 16,0 ± 6,0 балла. У всех больных регистрировался системный воспалительный ответ (по наличию клинических признаков системного воспаления: ССВО I — 45 %, ССВО II — 35 %, ССВО III — 20 %) (Bone еt al., 1991). В динамике оценивалась органная недостаточность по шкале SOFA: при поступлении 5,0 ± 3,0 балла. Отметим, что показатель SOFA на вторые сутки снижался до минимальных значений, что в совокупности с клиническими данными характеризует регресс полиорганной недостаточности и благоприятный прогноз сочетанной травмы.

В первые сутки пострадавшим были выполнены оперативные вмешательства (по клиническим, лабораторным и инструментальным показаниям) в объеме остановки кровотечения и иммобилизации переломов.

Интенсивная терапия:

1) нормализация объема циркулирующей крови путем целенаправленной инфузионно-трансфузионной терапии с достижением целевых значений среднего АД  80 мм рт.ст., венозной сатурации — не менее 65 % и уровня гематокрита — не менее 0,30;

2) респираторная поддержка у всех больных в объеме от масочной инсуффляции кислорода до перевода на искусственную вентиляцию легких в режиме контроля по давлению;

3) обезболивание опиатными агонистами;

4) нутритивная поддержка с исключением иммунных смесей из расчета 15–20 ккал/кг/сутки, преимущественно энтеральным путем после коррекции гемодинамики и метаболического ацидоза;

5) симптоматическая терапия.

Все пациенты переведены в профильные отделения и выписаны с улучшением. Контрольную группу составили 11 человек (8 мужчин, 3 женщины, средний возраст 35,8 ± 4,1 года), данные показателей сывороточных маркеров апоптоза которых были приняты за норму.

Венозная кровь забиралась при поступлении, далее на 2-е, 3-и, 5-е и 7-е сутки. Пробы крови центрифугировались, сыворотка сохранялась до проведения исследования при температуре –70 °С. В сыворотке определяли sAPO-1/Fas (растворимый Fas-рецептор, sFas), sFas-L (растворимый Fas-лиганд), Bcl-2 и р53 методом иммуноферментного анализа на планшетном фотометре Multiskan-EX (Labsystems, Финляндия) наборами фирмы Bender MedSystems (Австрия) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Материал обработан статистически с помощью программы Statistica 7.0, данные приведены как средняя ± стандартное  отклонение.

Результаты и обсуждение

Система Fas-L/Fas

У пациентов с сочетанной травмой в первые сутки определялся исходно высокий уровень sAPO-1/Fas (410,9 ± 89,7 пг/мл), который резко снижался на вторые сутки, оставаясь при этом достоверно выше контрольных значений, составлявших для sAPO-1/Fas 108,0 ±  ± 12,0 пг/мл (р < 0,01). Далее уровень sAPO-1/Fas увеличивался, достигая максимума на пятые сутки (419,5 ±  ± 94,5 пг/мл) (рис. 1). К седьмым суткам происходило заметное снижение по сравнению с пятыми сутками, однако показатель оставался достоверно выше, чем в контрольной группе (р < 0,01).

Уровень растворимого Fas-лиганда исходно почти в три раза превышал контрольные значения, составлявшие 48,0 ± 14,0 пг/мл, и с третьих суток повышался параллельно sAPO-1/Fas, также достигая максимума на пятые сутки, а на седьмые — снижаясь до исходных величин.

Система Fas-L/Fas является одним из наиболее значимых механизмов, регулирующих индукцию апо­птоза. Fas-рецептор (CD95) — это белок на клеточной поверхности, наиболее изученный член семейства TNF-мембранных рецепторов. Fas экспрессируется в различных типах клеток, включая тимоциты, активированные В-клетки, Т-клетки, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, а также в неиммунных клетках в легких и сердце [8, 9]. Fas также широко экспрессируется всеми клетками печени и играет центральную роль в различных заболеваниях печени [10]. Fas опосредует апоптоз в том случае, когда он связывается со специфическими белками. Естественный специфически связывающийся с Fas белок — его лиганд, или Fas-L массой 40 kDa, который является мембранным белком типа II и принадлежит семейству TNF. Fas-L доминирует на активированных Т-клетках и NK-клетках. Таким образом, Fas-L-опосредованная клеточная гибель связана с Т-клеточной или NK-клеточной цитотоксичностью, некоторыми видами патологического повреждения тканей и регуляцией лимфоцитарного гомеостаза. Молекула Fas-L может «отрезаться» от мембраны матриксной металлопротеиназой и переходить в растворимую форму sFas-L.

Fas-опосредованный апоптоз играет важную роль в воспалительном ответе. Растворимые формы sFas образуются в результате альтернативного сплайсинга мРНК [11].Механизмы регулирующего действия sFas в организме еще до конца не изучены. Предполагают, что растворимые формы ингибируют апоптоз, блокируя связывание мембранной формы Fas с Fas-L за счет взаимодействия в кровотоке [12, 13].

Сепсис, шок и травма ассоциированы с индукцией системного воспаления и последующей активацией лейкоцитов, приводящей к дисрегуляции и активации иммунных клеток и далее к повреждениям органов и развитию ПОН. В исследовании [14] было показано, что нейтрофилы способны индуцировать смерть клеток легочного эпителия через высвобождение sFas-L. Мы предполагаем, что в ответ на повышение Fas-L происходит выброс sFas, как защитный механизм от возможных аутоиммунных повреждений. В эксперименте было показано, что sFas проявляет цитотоксичность в культуре лимфоцитов, в то время как Fas-L частично блокирует этот эффект [12]. Снижение sFas и sFas-L на вторые сутки, возможно, связано с индукцией апоптоза и потерей лимфоцитов. Исследования состояния лимфоцитов в раннем посттравматическом периоде показывают резкое снижение содержания этих клеток уже в течение первых 24 часов после травмы. Соотношение Fas и Fas-L является одним из показателей, характеризующих критическое состояние. При повышенной экспрессии Fas-L и недостатке sFas обширный апоптоз в органах и тканях приводит к развитию полиорганной недостаточности, а при избытке sFas массовая гибель лимфоцитов может вызывать иммуносупрессию.

BCL-2 и р53

Уровень Bcl-2 в сыворотке крови в первые сутки был достоверно выше, чем в контрольной группе (7,11 ±  ± 5,55 нг/мл; р < 0,01) и составлял 26,5 ± 6,3 нг/мл. На пятые сутки происходило значительное повышение концентрации Bcl-2 до 39,8 ± 8,8 нг/мл, однако к седьмым суткам уровень Bcl-2 снижался до 22,8 ± 4,3 нг/мл (рис. 2).

Ген Bcl-2 открывает новое семейство генов, причастных к регуляции апоптоза и повышению жизнеспособности клеток без воздействия на клеточную пролиферацию. Ген Bcl-2 выполняет уникальную среди онкогенов млекопитающих функцию в качестве негативного регулятора апоптоза. Основной функцией Bcl-2 и его антиапоптотических белков является сохранение целостности митохондрий, обеспечивая синтез АТФ и ингибируя высвобождение проапоптотических факторов, в частности цитохрома С, который активирует каспазный каскад, неминуемо ведущий к апоптозу (R.J. Youle, А. Strasser, 2008). Способность Bcl-2 образовывать на наружной митохондриальной мембране гетеродимеры с проапо­птотическими белками семейства ингибирует прямую пермеабилизацию мембраны, тогда как способность ингибировать высвобождение Ca2+ из ЭПР препятствует транспорту Ca2+ в митохондрии, тем самым предотвращая открытие РТР (permeability transition pores — поры временной проницаемости).

Белок р53 является транскрипционным фактором, запускающим внутренний путь апоптоза. В здоровых клетках концентрация р53 поддерживается на низком уровне благодаря его короткому периоду полужизни и деградации в протеосомах [14, 15]. На ранних этапах изучения индукции р53 было установлено, что активность р53 появляется в ответ на повреждения ДНК. Условия для появления генетически измененных клеток возникают при самых разнообразных сбоях физиологических процессов. Описан целый ряд состояний, способных активировать р53. К ним относится состояние гипоксии и ишемии, состояние гипероксии, отсутствие или избыток некоторых цитокинов, действие окиси азота и многое другое. Все эти состояния вызывают характерные для каждого из них модификации как самого белка р53, так и систем, контролирующих его уровень и активность [15].

У пациентов с сочетанной травмой в первые сутки уровень р53 в сыворотке крови в три раза превышал контрольные значения, составлявшие 2,3 ± 0,4 ед/мл, и достигал 7,21 ± 3,39 ед/мл. На вторые и третьи сутки наблюдалась тенденция к снижению концентрации р53 до контрольных величин — 2,52 ± 1,03 ед/мл к третьим суткам, однако на пятые сутки определялся всплеск уровня р53 до 9,73 ± 5,01 ед/мл. Помимо регуляции транскрипции р53 может напрямую взаимодействовать с белками семейства Bcl-2. В семейство Bcl-2 белков входят как анти-, так и проапоптотические белки, которые содержат гомологичные последовательности внутри консервативного участка, известного как Bcl-2-гомологичные домены [16]. Возможно, увеличение уровня р53, индуцированное гипоксией, приводит к повышению концентрации антиапоптотического белка Bcl-2 [16].

Заключение

Динамика приведенных и анализированных показателей позволяет предполагать, что вследствие сочетанной травмы апоптоз развивается в клетках различных органов и тканей как по внешнему пути — через «рецепторы смерти», так и по внутреннему — через регуляцию проницаемости митохондриальных мембран.