Журнал «Травма» Том 13, №2, 2012

Вступ

Захворювання опорно-рухового апарату, як правило, супроводжуються остеопорозом, патологією, що посідає чільне місце в рейтингу основних медико-соціальних проблем сучасності. Поряд зі значною поширеністю в останні роки спостерігається стійка тенденція до прогресування порушень мінеральної щільності кісткової тканини у клінічно здорових молодих людей віком 18–25 років, тобто у період, коли завершується формування піка кісткової маси [1, 2]. В основі розвитку остеопорозу лежить інгібування процесу ремоделювання кісткової тканини внаслідок порушення регуляторних взаємозв’язків між остеокластами і остеобластами, що супроводжується зростанням активності остеокластів і зменшенням кількості й активності остеобластів. Інгібування процесу остеогенезу та підвищення процесу активності резорбції кісткової тканини обумовлює зменшення маси та щільності кісткової тканини, підвищення крихкості кісток та ризику їх переломів [3, 4]. Одним із важливих факторів, що сприяє розвитку остеопорозу, є дефіцит кальцію в організмі внаслідок недостатнього надходження або порушення обміну вітаміну D₃, особливо у людей похилого віку, жінок постклімактеричного періоду, при довготривалому призначенні кортикостероїдів, при онкологічних захворюваннях кісткової тканини тощо [5, 6].

При лікуванні різних форм остеопорозу з метою пригнічення активності остеокластів широко використовують бісфосфонати — синтетичні аналоги природного неорганічного пірофосфату [7]. Завдяки високій спорідненості до мінеральних компонентів бісфосфонати ефективно зв’язуються з кальцій-фосфатами кристалів гідроксіапатитів, забезпечують високу локальну концентрацію у зоні резорбції кісткової тканини та гальмують процес демінералізації [8]. Пряма дія бісфосфонатів на клітини кісткової тканини полягає у тому, що вони інгібують метаболізм, функціональну активність та індукують апоптоз остеобластів, унаслідок чого гальмується кісткова резорбція. Одночасно бісфосфонати зменшують апоптоз остеобластів та остеоцитів [9, 10]. Механізм пригнічення активності остеокластів бісфосфонатами може полягати в утворенні нездатних до гідролізу АТР-аналогів, що інгібують АТР-залежні процеси та посилюють апоптоз остеокластів. Бісфосфонати, що містять нітрогенумісний бічний ланцюг, також посилюють апоптоз остеокластів, але через інгібування активності фарнезилпірофосфатсинтази, ключового регуляторного ензиму на шляху використання мевалонової кислоти в синтезі холестеролу, інших стеролів та ізопреноїдів. Зниження активності фарнезилпірофосфатсинтази веде до гальмування процесу пренілювання (фарнезилювання та геранілгеранілювання) — посттрансляційної модифікації протеїнів, включаючи невеликі GTP-зв’язувальні протеїни, такі як Rab, Rac, Rho, що відіграють центральну роль у регулюванні ключових процесів клітинної активності остеокластів, включаючи сигнальну трансдукцію, регуляцію їх проліферації, диференціації та апоптоз [11]. Позитивний ефект бісфосфонатів у лікуванні патологій кісткової тканини може проявлятись через активацію метаболічних перетворень вітаміну D₃ — основного регулятора структурно-функціонального стану кісткової тканини.

Мета роботи — вивчити взаємодію вітаміну D₃ та бісфосфонатів у регулюванні структурно-функціонального стану кісткової тканини та мінерального обміну за експериментального аліментарного остеопорозу.

Матеріали і методи досліджень

Дослідження проводили на щурах лінії Wistar масою 100 ± 5 г. Аліментарну модель остеопорозу викликали шляхом утримання щурів на D-гіповітамінозній дієті згідно з ГОСТом 11222-65 протягом 30 діб. Щурам із розвиненим аліментарним остеопорозом вводили внутрішньошлунково за допомогою зонду досліджувані препарати у вигляді водної суспензії об’ємом 0,1 мл протягом 10 діб. Контрольні тварини утримувались на повноцінному раціоні віварію.

Рівень кальцію, активність загальної лужної фосфатази та її ізоензимів у сироватці крові визначали за допомогою біотест-наборів («Лахема», Чехія); вміст неорганічного фосфору — після осадження протеїнів 12 % розчином ТХУ методом Dyce [12]; уміст 25OHD₃, активного метаболіту вітаміну D₃ — імуноферментним методом із використанням набору Vitamin D25-OH ELISE Kit виробництва фірми Immunodiagnostik (Германія). Вітамін D₃ 25-гідроксилазну активність у гепатоцитах визначали згідно з описаним вище і виражали в пмолях утвореного 25ОНD₃ за 2 год інкубації на 106 гепатоцитів [13].

Остеометричні та гістологічні дослідження проводили на стегнових та великогомілкових кістках. Гістологічні зрізи кісткової тканини отримані в блоках целоїдину забарвлювали гематоксиліном, еозином та пікрофуксином за ван Гізоном [1]. Зольність кісткової тканини визначали методом сухої мінералізації при температурі 500–600 °С після її знежирення гексаном протягом 7 діб і розраховували щодо маси кісткової тканини. Вміст мінеральних компонентів у золі визначали вищеописаними методами.

Усі маніпуляції з тваринами проводили під легким ефірним наркозом та без порушень норм гуманного поводження з лабораторними тваринами, що не суперечить загальноприйнятим біоетичним нормам з дотриманням відповідних міжнародних положень стосовно проведення експериментальних робіт. Статистичну вірогідність результатів оцінювали в програмі SigmaPlot2000 з використанням t-критерію Стьюдента.

Результати та їх обговорення

Результати остеометричних, гістоморфологічних та біохімічних досліджень підтверджують розвиток аліментарної форми остеопорозу у щурів, яких утримували протягом 30 діб на вітамін D-дефіцитному раціоні. У піддослідних тварин знижується довжина та товщина дистального епіметафізу стегнової та великогомілкової кісток, відзначається зниження маси і зольності великогомілкової кістки, що супроводжується зниженням вмісту кальцію та фосфору в цій кістці (табл. 1).

Результати гістоморфологічних досліджень свідчать про гіпертрофію хрящових клітин, стоншення компактної кісткової тканини, порушення формування остеонів, вставних пластинок та внутрішніх оточуючих пластинок [1], що підтверджується даними гістометрії зони росту та структурної організації епіфізарного хряща стегнової та великогомілкової кісток (табл. 2).

Таким чином, за умов утримання дослідних тварин протягом 30 діб на D-гіповітамінозній дієті у них розвивається аліментарна форма остеопорозу, яка супроводжується порушенням росту кісток, структурно-функціонального стану кісткової тканини та епіфізарного хряща і проявляється порушенням формування остеонової структури та оточуючих кісткових пластинок, зупинкою вростання судин та процесом окостеніння і проліферації хрящових клітин.

Встановлення патогенезу розвитку остеопорозу обумовило цілеспрямоване застосування широкого кола лікарських препаратів у його терапії. До них належать бісфосфонати, вітамін D₃, кальцій, селективні модулятори естрогенових рецепторів (інгібують резорбцію кісток), рекомбінантний паратиреоїдний гормон людини — анаболічний агент для кісток (стимулює утворення кісткової тканини шляхом зниження апоптозу остеобластів і тим самим підвищує кількість остеобластів та їх диференціацію), стронцію ранелат (гальмує резорбцію та посилює утворення кісток), тіболон — синтетичний стероїд, що має остеогенну, андрогенну та прогестагенну дію, тестостерон (посилює утворення кісток), деносумаб — моноклональні антитіла до ліганду активатора рецептора ядерного фактора kB (RANKL NF-kB), зв’язування яких викликає інгібування остеокластогенезу та, відповідно, зменшує резорбцію кісток [14].

Особливо ефективним підходом слід вважати поєднане застосування декількох із зазначених препаратів [15]. Тому в роботі було проведено дослідження сумісної дії бісфосфонатів різної структури, які з високою специфічністю зв’язуються з гідроксіапатитами кісткової тканини, та вітаміну D₃ — основного регулятора структурно-функціональної активності кісткової тканини, що через вплив на експресію генів регулює формування кісткової тканини у процесі розвитку й ремоделювання протягом життєвого циклу. З цією метою щурам із аліментарним остеопорозом на тлі вітаміну D₃ вводили різні форми бісфосфонатів — метиленбісфосфонової кислоти динатрієву сіль (МБФК) та алендронат.

Розвиток аліментарного остеопорозу у піддослідних щурів супроводжується чітко вираженими порушеннями мінерального обміну, що виявляється як гіпокальціємія та гіпофосфатемія. Вміст загального кальцію в сироватці крові знижується на 35,3 %, вміст фосфору неорганічного — на 30,5 % (табл. 3).

При введенні тваринам із остеопорозом вітаміну D₃ рівень мінеральних компонентів у сироватці крові зростає, але є нижчим від показників контрольних тварин унаслідок короткого (10 днів) терміну призначення холекальциферолу. Спільне призначення бісфосфонату — МБФК з вітаміном D₃ супроводжується вірогідним зростанням рівня кальцію й фосфору у сироватці крові порівняно з групою тварин, яким уводили лише вітамін D₃. В той же час введення алендронату на тлі вітаміну D₃ знижує його ефект щодо нормалізації вмісту мінеральних компонентів у сироватці крові. Більше того, вміст кальцію та фосфору у крові тварин цієї групи був нижчим, ніж у групі, яка отримувала МБФК на тлі введення холекальциферолу.

Результати виявлених змін мінерального обміну підтверджуються даними щодо впливу різних бісфосфонатів на активність лужної фосфатази — ензиму, що здійснює гідроліз органічних фосфатів та перенесення фосфат-аніонів на органічні компоненти перицелюлярного матриксу, тобто є біомаркером активності остеобластів. Із наведених у табл. 4 даних випливає, що за остеопорозу у сироватці крові значно зростає активність загальної лужної фосфатази (на 67,8 %), в основному за рахунок її кісткової ізоформи (на 68,4 %), яка за активністю значно (майже в 4 рази) перевищує кишкову ізоформу. Спільне введення вітаміну D₃ із МБФК призводить до більш значного зниження активності лужної фосфатази, головним чином, за рахунок її кісткового ізоензиму, порівняно з уведенням лише холекальциферолу. В той же час введення алендронату на тлі вітаміну D₃ супроводжується зниженням активності лужної фосфатази порівняно з групою, яка отримувала лише вітамін D₃, але є вірогідно вищим порівняно з групою, якій вводили таку саму дозу МБФК. Виявлені зміни стосуються переважно кісткового ізоензиму. Зростання активності кишкової форми лужної фосфатази при остеопорозі може бути в основному пов’язаним із підвищеним виходом ізоензиму з ентероцитів унаслідок порушення структури їх мембран, оскільки за умов D-гіповітамінозу синтез цієї форми ензиму інгібується.

Виявлені порушення структурно-функціонального стану кісткової тканини, епіфізарного хряща та мінерального обміну за аліментарного остеопорозу обумовлені недостатнім надходженням в організм вітаміну D₃. Найбільш використовуваним та вірогідним показником забезпеченості організму вітаміном D₃ є вміст його гідроксильованої форми — 25-гідроксихолекальциферолу (25OHD₃) у крові. Як свідчать результати, наведені у табл. 5, за умов остеопорозу вміст 25ОНD₃ у сироватці крові знижується у 4 рази і становить 30,8 ± 1,5 нмоль/л^–1, що згідно з сучасною характеристикою вітамінної забезпеченості класифікується як D₃-вітамінний дефіцит. Одночасно вітамін D₃ 25-гідроксилазна активність у гепатоцитах зростає в три рази порівняно з їх активністю у контрольних тварин. За введення щурам із остеопорозом 40 МО вітаміну D₃ протягом 10 діб уміст 25ОНD₃ у сироватці крові підвищується на 183 %.

Вміст 25ОНD₃ у сироватці крові та вітамін D₃ 25-гідроксилазна активність у гепатоцитах суттєво відрізняються за введення на тлі вітаміну D₃ різних бісфосфонатів — МБФК або алендронату. Так, за спільного введення вітаміну D₃ з МБФК уміст 25ОНD₃ зростає (на 24 %) порівняно з групою, якій вводили тільки вітамін D₃, а також посилюється вітамін D₃ 25-гідроксилазна активність у гепатоцитах практично до рівня контролю. Можна припустити, що МБФК знімає інгібуючий ефект 25ОНD₃ на активність гідроксилюючих ензимів або активує їх синтез. Механізм такого позитивного ефекту на даний час не встановлений. На противагу цьому в групі, тваринам якої на тлі вітаміну D₃ вводили алендронат, вітамін D₃ 25-гідроксилазна активність значно (в 3,2 раза) знижувалась порівняно з групою, що отримувала лише вітамін D₃. Інгібування вітамін D₃ 25-гідроксилазної активності алендронатом супроводжується більш низьким рівнем забезпеченості організму 25ОНD₃. На нашу думку, саме гальмування алендронатом вітамін D₃ 25-гідроксилаз у гепатоцитах може пояснювати низьку ефективність нітрогенумісних бісфосфонатів у поєднанні з вітаміном D₃, що обумовило використання гормонально активної форми вітаміну D₃ — 25(OH)₂D₃ у терапії остеопорозу бісфосфонатами з аналогічною структурою [3, 7, 8, 14]. Отже, встановлено, що МБФК є синергістом вітаміну D₃ у регуляції структурно-функціонального стану кісткової тканини, та обґрунтована доцільність їх комплексного використання в терапії остеопорозу.

Висновки

1. Доведено, що бісфосфонати з різною структурою (МБФК та алендронат) суттєво відрізняються за здатністю нормалізувати мінеральний обмін та структурно-функціональний стан кісткової тканини за аліментарного остеопорозу.
2. ₃щурам з аліментарним остеопорозом активує, а алендронат інгібує вітамін D₃ 25-гідроксилазну активність у гепатоцитах, що обумовлює суттєві відмінності у синтезі та забезпеченості організму гідроксильованою формою вітаміну D₃ — 25ОНD₃.
3. Проведені дослідження обґрунтовують доцільність спільного використання препаратів вітаміну D₃ та бісфосфонату — метиленбісфосфонової кислоти динатрієвої солі у лікуванні остеопорозу.