Журнал «Здоровье ребенка» 5 (40) 2012

Бронхиальная астма (БА) по социально­экономическому ущербу, влиянию на уровень здоровья и качество жизни пациентов входит в число первых трех патологий в структуре заболеваний человека [1, 2]. Хроническое рецидивирующее течение БА, часто проявляющееся в раннем детстве и продолжающееся в течение всей жизни, может быть причиной не только инвалидности, но и смертельных исходов, что определяет необходимость исследования сложных невыясненных механизмов развития данной патологии с целью разработки эффективных методов диагностики и профилактики [5].

Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы (GINA) является основным международным стандартом диагностики и лечения бронхиальной астмы [5]. Согласно разработанной схеме, для лечения используется ступенчатый подход — изменение объема терапии в зависимости от тяжести течения заболевания. Глюкокортикостероидные препараты (ГКС), обладающие выраженной противовоспалительной активностью, подавляют острое и хроническое воспаление, повышают апоптоз эозинофилов и усиливают транскрипцию генов, отвечающих за выработку противовоспалительного белка липокортина­1, ингибирующего фосфолипазу А2, синтез лейкотриенов, простагландинов, способствуют уменьшению выработки противовоспалительных цитокинов [9, 15].

Базовые принципы терапии болезни разработаны весьма детально и позволяют страдающим астмой пациентам поддерживать определенный уровень жизни и чувствовать себя полноценными членами общества. Принципиально важно своевременно диагностировать заболевание и сразу же ориентировать больного на необходимость длительного адекватного лечения в условиях регулярного врачебного наблюдения.

Общая стратегия лечения четко определена: в основе терапии лежит принцип сугубо индивидуального подхода к пациентам с учетом причин развития, клинических особенностей течения бронхиальной астмы, формы и фазы заболевания [5]. У некоторых детей на фоне терапии низкими и средними дозами ингаляционных ГКС (ИГКС) не удается достигнуть полного контроля, что может быть связано с гетерогенностью индивидуального ответа на противоастматическое лечение. Причиной этому может быть генетически детерминированное тяжелое течение атопии, что изначально определяет необходимость назначения высоких доз ИГКС для достижения полного контроля над заболеванием с последующим снижением объема терапии [14, 18].

Особенность терапии бронхиальной астмы приводит к тому, что лечение и профилактика заболевания практически неразрывны и не могут рассматриваться отдельно. Профилактика тяжелого течения бронхиальной астмы — важная система комплексных мер, направленная на предупреждение прогрессирования заболевания и обострения симптомов у тех, кто ее уже имеет, а также уменьшение неблагоприятных последствий патологии [5]. Сегодняшние задачи, стоящие перед аллергологами, принципиально отличаются от тех, которые ставили наши не столь уж далекие предшественники, заложившие научный фундамент иммунологии, — именно ориентация на превентивную медицину должна быть приоритетным направлением, объединяющим интересы многих специалистов как в фундаментальных, так и прикладных областях науки, и должна стать базисом всей аллергопатологии.

Важно подчеркнуть, что для внедрения в практическую медицину профилактических мероприятий атопии необходимо наличие прогностических маркеров бронхиальной астмы. Но, к сожалению, мы должны признать, что сегодняшняя медицина посвящена острым и неотложным состояниям, а профилактика БА или предупреждение ее прогрессирования оставляют желать лучшего. Безусловно, превентивная медицина нуждается во времени, поэтому ее зачастую просто игнорируют. И все это в период, когда доказано, что профилактика является единственной надеждой в аллергологии.

Поэтому недостаточно изученные генетические аспекты предрасположенности к бронхиальной астме выдвигают новые перспективы в разработке диагностических критериев, индивидуальных программ профилактики и стратегии лечения атопической патологии [7, 9, 14].

На протяжении последних лет генетика врожденного иммунитета стала центром активных международных исследований как возможное патогенетическое звено атопии [7, 11–13, 16, 18]. Среди клеточных паттернраспознающих рецепторов главную роль в распознавании патогенов играют Toll­подобные рецепторы (Toll­like receptors — TLR), которые экспрессируются конститутивно и постоянно находятся в составе клеточной мембраны лейкоцитов, готовые к встрече и распознаванию патогенов [7, 16, 19]. В последние годы накапливается все больше сведений о патологиях, связанных с дефектами в системе Toll­подобного рецептора 4. В настоящее время перспективно рассматривается концепция точечных замен в геномной ДНК (однонуклеотидный полиморфизм), которые вносят изменения в структуру Toll­подобного рецептора 4, нарушая тем самым регуляцию врожденной иммунной системы при взаимодействии с липополисахаридом, что может быть ключевым фактором дисбаланса Т₁/Т₂­хелперов начиная с раннего неонатального периода [17].

Поскольку различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут определять различный характер течения воспалительного ответа и спе­цифических иммунологических реакций при внедрении чужеродных агентов, изучение распространенности однонуклеотидных замен у детей с бронхиальной астмой особо актуально в сфере детской иммунологии и аллергологии.

Цель нашего исследования: определить маркеры генетически детерминированного тяжелого течения БА, обосновать лечебную тактику у детей с полиморфизмом Asp299Gly Toll­подобного рецептора 4.

Объекты и методы исследования

Нами обследована группа детей, больных бронхиальной астмой, в возрасте 6–10 лет (n = 53). В качестве материала исследования использовали периферическую венозную кровь. Для изучения генотипа гена Toll­like рецептора 4 выделяли геномную ДНК методом фенол­хлороформной экстракции. Полиморфный участок Asp299Gly генотипировали методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров. Амплификация проводилась на амплификаторе «Терцик» («ДНК­Технология», Москва). Группу контроля составили 95 практически здоровых людей с базы генетических образцов НИИ генетических и иммунных основ развития патологии и фармакогенетики ВГУЗУ «УМСА».

Полученные результаты статистически обработаны параметрическими и непараметрическими критериями с использованием Statistica for Windows 7.0 (StatSoft Inc.) и электронных таблиц MS Excel. Распределение частот аллелей между группами изучали с помощью c² Пирсона с поправкой Йетса на беспрерывность при числе степеней свободы, равных 1. Сопоставление частот генотипов между исследуемыми группами проводили с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот вариантов в независимых группах использовали показатель отношения шансов (ОШ) с определением 95% доверительного интервала (ДИ). Для всех видов анализа статистически значимыми считались отличия при р < 0,05 [3, 10].

Результаты исследования

Для определения подходов к диагностике, ведению и лечению больных бронхиальной астмой проведено анкетирование пациентов, а также изучение историй болезни всех обследуемых. На момент включения в исследование средний возраст детей составил 7,82 ± 2,25 года. При ретроспективном анализе развития заболевания и времени, прошедшего от момента появления первых симптомов бронхообструкции до постановки диагноза, оказалось, что из 53 больных лишь у 18 % пациентов диагноз был установлен в течение первого года от появления симптомов, а у 82 % — в срок более 3 лет от начала заболевания. Все пациенты за этот период неоднократно обращались к врачу, большинство находились на диспансерном учете с диагнозом обструктивного или рецидивирующего бронхита. Следовательно, в детской аллергологии по­прежнему наблюдается поздняя диагностика заболевания, что обусловлено сложностью диагностических критериев у детей младшего возраста.

Следующим этапом нашего изучения стало исследование распространенности полиморфизма Asp299Gly гена Toll­подобного рецептора 4 в группе больных детей и сравнительная характеристика с соответствующими данными здоровой популяции. Анализ распределения частот генотипов по исследуемому гену в группах наблюдения отображен в табл. 1. Исходя из полученных результатов, у 96,85 % здоровых обследуемых определялись нормальный генотип TLR4 (АА) и два мутантных — частота гетерозигот (AG) составила 2,1 %, гомозигот (GG) — 1,05 %, в то время как у детей с атопической БА частота мутантного гетерозиготного и гомозиготного генотипов в 5,39 и 1,79 раза соответственно превышала показатели контроля (AG — 11,32 %, GG — 1,88 %, р = 0,0385).

Изучение распространенности нормальной и мутантной аллели 299Gly гена Toll­подобного рецептора 4 в обследуемых группах (табл. 2) показало, что среди здоровых аллель 299Аsp встречалась с частотою 97,89 %, а аллель 299Gly — 2,11 %. У детей с бронхиальной астмой соответственная частота составила 92,45 и 7,54 %, что в 3,5 раза превосходило распространенность полиморфной аллели в группе контроля (табл. 2).

Согласно полученным результатам в распространенности однонуклеотидного полиморфизма, с целью дифференциации особенностей манифестации и течения атопического процесса нами сформированы две подгруппы больных: І — с диагностированным полиморфизмом Asp299Gly (генотипы AG, GG) и ІІ — с нормальным распределением аллелей генотипом АА гена Toll­подобного рецептора 4.

При анализе факторов риска было отмечено, что сопутствующие аллергические заболевания наблюдались у большинства обследуемых. Манифестация атопического дерматита (АД) у больных первой подгруппы (84,7 %) наблюдалась в возрасте до 1 года, в то время как для других пациентов характерной была более поздняя клиника кожного синдрома (после 2 лет). Среди больных с нормальным генотипом преобладало легкое течение АД, а тяжелые формы кожных проявлений атопии отмечены у пациентов с диагностированной мутацией. Согласно анамнезу для больных первой подгруппы характерной была неэффективность назначенной терапии АД (длительное применение антигистаминных препаратов 1­го поколения, эпизодическое использование топических глюкокортикостероидов, увлажняющих средств). Легкое течение АД у детей второй подгруппы корригировалось гипоаллергенной диетой и не нуждалось в назначении базисной терапии. Кроме того, у этих пациентов в 82,6 % случаев зафиксирована длительная ремиссия. Необходимо подчеркнуть, что между возрастом пациентов и тяжестью течения АД установлена отрицательная корреляция (r = –0,58; р = 0,04). Полученные результаты согласуются с современными представлениями об атопии как о системном заболевании, в рамках которого более тяжелое течение кожного синдрома сопровождается ранней манифестацией респираторных форм аллергии [9]. То есть неэффективная терапия кожных проявлений атопии является связующим звеном к переориентации органов­мишеней и формированию респираторных форм аллергии.

Выявлена ассоциация мутантного генотипа с развитием персистирующего аллергического ринита, который более чем в 2 раза чаще реализовался у детей первой подгруппы, чем у больных с нормальным генотипом (р < 0,001). Ретроспективное изучение анамнеза заболевания дало возможность установить более раннее формирование респираторных форм аллергии у детей с полиморфизмом Asp299Gly гена Toll­подобного рецептора 4: эпизоды обструктивного бронхита (р < 0,001) и стенозирующего ларинготрахеита на первому году жизни более чем в 5 и 3 раза соответственно превосходили данные показатели у пациентов с нормальным генотипом (р < 0,001) (рис. 1).

Согласно полученным данным, у пациентов с полиморфизмом средний возраст появления первых симптомов БА составил 1,80 ± 0,47 года, а у больных с нормальным генотипом — 5,16 ± 0,32 года. В работах многих ученых показано, что раннее начало БА связано с более значимыми легочными нарушениями и персистенцией симптомов у взрослых [7, 9, 14]. Поэтому установление генотипа Toll­подобного рецептора 4 может способствовать своевременной постановке диагноза БА и обоснованному назначению базисной противовоспалительной терапии, так как диагностика бронхообструктивного синдрома у детей раннего возраста ­осложняется «масками» БА, требует много времени для дифференциации и откладывает назначение базисной терапии на длительный период.

Исследуя особенности течения респираторных проявлений аллергии, нами подчеркнуто превалирование количества эпизодов бронхообструкции у пациентов с мутацией, что в 3 раза выше соответствующих данных у детей с нормальным генотипом (р < 0,05). Поэтому риск формирования тяжелых форм БА достоверно выше у пациентов с полиморфизмом гена TLR4 (RR = 12,42; ДИ 95% 4,0–38,4; р = 0,002). Нормальная аллель 299А значительно уменьшает вероятность формирования тяжелых вариантов болезни (RR = 0,2; ДИ 95% 0,12–0,31; р < 0,001), в то время как носительство аллели 299G увеличивает возможность ранней манифестации бронхиальной астмы (RR = 5,88; ДИ 95% 3,67–9,42; р = 0,003), а также способствует прогрессированию и неконтролируемому течению патологии.

Показатели функции внешнего дыхания (ОФВ₁) были нарушенными у большинства носителей генотипа GG гена TLR4 (рис. 2) и составили в среднем 76,43 ± 5,80 % (р = 0,001), что значительно ниже соответствующих показателей у детей с нормальным распределением аллелей (84,9 ± 8,7 %).

Важно отметить, что в период реализации БА ни один из пациентов первой подгруппы не получал соответствующей ступенчатой терапии ингаляционными глюкокортикостероидами, а лечебная тактика была сконцентрирована вокруг симптоматического лечения. Генотипы Asp/Gly и Gly/Gly у больных первой подгруппы ассоциировались с развитием более тяжелых форм астмы, в то время как у больных с нормальным распределением аллелей TLR4 наблюдалась реализация БА легкой степени (р < 0,001).

Отвечая на вопрос вероятности достижения полного контроля над заболеванием, то она значимо выше у пациентов с нормальным генотипом (OШ = 4,03; ДИ 95% 1,14–12,78; p = 0,003). Наличие мутантной аллели 299G более чем в 4 раза увеличивает вероятность неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы (OШ = 4,13; ДИ 95% 1,05–1,44; p = 0,02).

С открытием субпопуляций Th₁­ и Th₂­клеток стало очевидным, что продукция IgE зависит от Th₂­лимфоцитов. При этом одним из главных цитокинов, связанных с Th₂­ответом, является интерлейкин­10 (IL­10). Проведенные нами исследования показали, что спонтанная продукция IL­10 достоверно выше в группе больных с полиморфизмом в отличие от больных с нормальным распределением аллелей и практически здоровых (рис. 3). Кроме того, самая высокая липополисахаридиндуцированная продукция IL­10 наблюдалась у детей с мутацией.

Результаты, полученные в данном исследовании, характеризуются продукцией цитокиновой сети IgЕ­зависимых процессов, что особенно выражено в разности биосинтеза и секреции IL­10. Для детей с мутацией характерна генетически детерминированная неэффективность мононуклеарных клеток на любые филогенные стимулы, что подтверждается дисбалансом иммунной системы, т.е. вялотекущий хронический процесс сопровождается недостаточным по интенсивности иммунным ответом, а защитные реакции неадекватны по сравнению с активностью патологических стимулов. В результате происходит наслоение новых обострений на незавершенный репаративный процесс, в конечном итоге формируется порочный круг.

Заключение

ХХ столетие ознаменовалось крупными достижениями в области клинической иммунологии и аллергологии, что не могло не отразиться на показателях заболеваемости и качества жизни пациентов. В то же самое время, несмотря на поступательное развитие науки, крупные открытия, сделанные в области диагностики и лечения БА, значимость которых нельзя оценить иначе как революционные, сегодня мы продолжаем сталкиваться с неуклонным ростом аллергопатологии, распространение которой грозит перейти эпидемический рубеж.

Полученные результаты заставляют нас по­новому взглянуть на механизмы возникновения атопии, научиться выявлять ранние маркеры аллергического воспаления у детей групп риска, используя клинические и генетические методы обследования, что позволит своевременно осуществлять мероприятия первичной и вторичной профилактики этого социально значимого заболевания. Комплексное генетическое исследование при БА позволит оптимизировать диагностические протоколы, что в значительной мере будет способствовать внедрению профилактического лечения для решения проблем трансформации одной формы аллергического заболевания в другую.