Журнал «Травма» Том 14, №2, 2013

Порушення репаративної регенерації кісток залишаються однією з невирішених проблем як у медичному, так і в соціально­економічному аспекті, оскільки посідають чільне місце серед причин тимчасової та стійкої непрацездатності населення [5]. З огляду на факт прогресуючого зростання техногенності травми, збільшення частоти множинних та комбінованих пошкоджень кісток з’ясування інтимних механізмів порушень репаративного остеогенезу та оптимізація методів профілактики та лікування незрощень довгих кісток і хибних суглобів є проблемою, яка потребує термінового вирішення.

Відомо, що перебіг репаративного остеогенезу залежить від локального кровообігу в зоні ушкодження [5], що певною мірою детермінується станом периферійних судин до моменту травми. В останні роки з’явились переконливі докази, що порушення ендотеліальної секреції вазоактивного медіатора оксиду азоту впливає на кісткову тканину [3, 4, 6] і асоціюється з порушенням структурно­функціонального стану кісткової тканини, розвитком остеопорозу та остеопоротичних переломів [9, 10]. В окремих експериментальних роботах висвітлено важливу роль NO в реалізації патогенетичних механізмів негативного впливу гомоцистеїну (ГЦ) на кістку. Так, за умов інгібування синтази оксиду азоту вірогідно потенціювався остеотоксичний ефект гіпергомоцистеїнемії (ГГЦ) [3] і пригнічувалась диференціація кісткоутворюючих клітин [11]. Тому постає питання й щодо ролі порушень судинної продукції оксиду азоту в процесах репаративного остеогенезу та формування хибних суглобів.

Одним із визнаних генетичних чинників, що суттєво порушує ендотеліальний синтез NO, є поліморфізм промотора гена eNOS Т786С [8]. Зниження здатності судинної стінки до продукції оксиду азоту, як відомо, пов’язане з включенням вазоконстрикторних механізмів, ішемією та тромбозами. Гіпотетично поліморфізм гена eNOS Т786С може виявитись фактором, що впливає на перебіг репаративного остеогенезу, однак досліджень у даному напрямку раніше не проводилось.

Мета роботи: вивчити поширеність поліморфізму промотора гена eNOS Т786С в осіб із консолідованими переломами та хибними суглобами довгих кісток та оцінити його зв’язок із клініко­рентгенологічними типами хибних суглобів, наявністю ускладнень, гіпергомоцистеїнемією та запальним синдромом.

Матеріал та методи

До групи спостереження увійшли 118 (20,13 %) із 586 обстежених хворих із хибними суглобами довгих кісток на рівні діафізу, які не мали встановлених об’єктивних та ятрогенних чинників порушень репаративного остеогенезу. Середній вік становив 39,34 ± 11,01 року. Осіб чоловічої статі було 91 (77,12 %), жіночої — 27 (22,88 %). Тривалість захворювання від 11 до 126 міс. За клініко­рентгенологічною характеристикою хибного суглоба нормопластичний тип діагностовано у 24 (20,34 %), гіперпластичний — у 21 (17,8 %), гіпопластичний — у 36 (30,5 %), атрофічний — у 37 (31,36 %) хворих. Рефрактури та нейродистрофічний синдром відмічались у 24 (20,34 %) та 39 (33,05 %) осіб відповідно. До групи контролю увійшли 48 хворих із консолідованими діафізарними переломами, порівнянні з групою хворих із хибними суглобами за віком, статтю, локалізацією ушкодження, частотою супутньої патології.

Забір крові для молекулярно­генетичних досліджень здійснювали в стандартних умовах — з 8:00 до 9:00, натще, після нічного голодування, з ліктьової вени за допомогою вакутейнерів у пробірки Vacuette (Greiner Bio­One, Австрія) з 3,8% розчином цитрату натрію (у співвідношенні 9 : 1) та без антикоагулянтів. Уміст загального ГЦ, медіаторів запалення С­реактивного білка (СРБ) та інтерлейкіну­6 (ІЛ­6) визначали імуноферментним методом за наборами Homocysteine EIA (Axis­Shield, Англія), hsCRP ELISA (DRG, США) та IL­6 ELISA (Diaclone, Франція) відповідно до інструкції фірми­виробника на аналізаторі STAT FAX 303/PLUS. При ранжируванні рівнів ГЦ користувались критеріями D.W. Jacobsen (1998) та референтними інтервалами, розробленими [1] для вітчизняної популяції здорових дорослих осіб. Ранжирування рівнів С­реактивного білка та інтерлейкіну­6 проводили згідно з вітчизняними критеріями та референтними інтервалами, розробленими І.І. Андрушко [2].

Для генетичних досліджень відбирали проби цільної крові, стабілізованої цитратом натрію, які до тестування зберігали при температурі –20 °С. Генотипування проводилось методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) із наступним рестрикційним аналізом продуктів ПЛР. Вивчалась мутація гена ендотеліальної синтази нітрогену монооксиду (NOS 3 Т786С).

Статистичний аналіз матеріалу проводився за допомогою стандартних методів із застосуванням пакету прикладних програм MS Excel XP та Statistica SPSS 10.0 for Windows (ліцензійний номер 305147890).

Результати і їх обговорення

При досліджені поліморфізму промотора гена eNOS Т786С було встановлено, що серед осіб із консолідованими переломами співвідношення нормальних гомозигот (786­ТТ), гетерозигот (786­ТС) та гомозигот із патологічним генотипом 786­СС становило 50,0, 43,8 та 6,2 % відповідно (табл. 1). Розподіл частот генотипів ТТ/ТС/СС у групі осіб із консолідованими переломами відповідав рівновазі Харді — Вайнберга і узгоджувався з даними щодо поширеності поліморфізму гена eNOS Т786С серед практично здорових осіб в українській популяції [7]. Розподіл частот зустрічальності вказаних генотипів у групі хворих із хибними суглобами також підкорявся закону Харді — Вайнберга, однак відрізнявся від такого в групі порівняння. Серед хворих із хибними суглобами спостерігалась тенденція до зменшення частки нормальних гомозигот 786­ТТ і вірогідно у 2,6 раза збільшувалась частка гомозигот 786­СС. Відповідно частота зустрічальності С­алелі серед хворих із хибними суглобами була вищою, ніж серед осіб із консолідованими переломами, і становила 37,7 % проти 28,1 %.

Типологічний аналіз показав, що серед хворих із нормопластичним типом поширеність С­алелі промотора eNOS та співвідношення генотипів ТТ/ТС/СС узгоджувались із такими в групі хворих із консолідованими переломами (50,0, 41,7 та 8,3 %). У групі осіб із гіперпластичним типом спостерігалось незначне зменшення частоти генотипу 786­ТТ та збільшення частоти генотипу 786­СС. У той же час серед хворих із гіпопластичним та атрофічним типом частка нормальних гомозигот 786­ТТ була меншою (в 1,4 раза), ніж серед хворих із нормопластичним типом, натомість частіше виявлялись гетерозиготи 786­ТС, а частка патологічних гомозигот 786­СС зростала в 2,3 та 2,6 раза відповідно. Частота С­алелі при авітальних типах хибних суглобів сягала 41,7–43,2 % порівняно з 29–31 % при вітальних типах.

Аналіз частот генотипів eNOS Т786С залежно від наявності нейротрофічного синдрому та рефрактур виявив суттєві відмінності між групами (табл. 2). Так, серед хворих із нейродистрофічним синдромом частота зустрічальності генотипу 786­ТТ була вірогідно меншою (у 2,5 раза), а патологічного генотипу 786­СС, навпаки, більшою (у 3,5 раза), ніж серед хворих без нейродистрофічного синдрому. Частота патологічної С­алелі в групі хворих із нейродистрофічним синдромом становила 55,1 % проти 29,0 % у групі хворих без цього ускладнення. Аналогічні за спрямованістю, хоча і менш виражені, тенденції виявились при аналізі частот генотипів eNOS Т786С у хворих із рефрактурами та без них. Зокрема, серед хворих без рефрактур частка нормальних гомозигот ТТ була вищою (в 1,8 раза), а частка патологічних гомозигот СС, навпаки, нижчою (у 2,3 раза), ніж серед хворих із рефрактурами.

Виявилось, що середній рівень ГЦ у патологічних гомозигот 786­СС вірогідно вищий (на 12,4 %), ніж у нормальних гомозигот 786­ТТ (табл. 3). Серед носіїв генотипу 786­СС також вірогідно частіше виявлялись хворі з ГГЦ, ніж серед носіїв генотипів 786­ТТ та 786­ТС.

Встановлено, що у хворих із хибними суглобами гетеро­ і особливо гомозиготне носійство С­алелі супроводжувалось вірогідним збільшенням умісту прозапальних медіаторів у сироватці крові (табл. 4). Так, у гетерозигот 786­ТС і гомозигот 786­СС рівень СРБ вірогідно перевищував такий у нормальних гомозигот ТТ на 23,9 та 46,6 %, а рівень інтерлейкіну­6 — на 13,4 та 35,4 % відповідно. Виявлені відмінності пояснюються більш високою частотою зустрічальності аберантних рівнів медіаторів запалення у хворих із хибними суглобами — носіїв патологічної С­алелі промотора гена eNOS (табл. 5).

Отже, за поширеністю поліморфізму промотора гена eNOS Т786С хворі з хибними суглобами відрізняються від осіб із консолідованими переломами: спостерігається зростання частоти зустрічальності патологічної С­алелі, вірогідно зростає частота генотипу СС і знижується частота нормального генотипу ТТ. Гомозиготи СС концентруються переважно в групах хворих із гіпопластичним та атрофічним типом хибних суглобів, на той час як частотний розподіл генотипів серед хворих із нормопластичним типом наближається до такого в осіб із консолідованими переломами.

Висновки

1. При генотипуванні eNOS Т786С у хворих із хибними суглобами довгих кісток спостерігали тенденцію до зменшення частки нормальних гомозигот 786­ТТ, збільшення кількості гетерозигот (786­СТ) та патологічних гомозигот (786­СС). Частота зустрічальності С­алелі серед хворих із хибними суглобами була вищою, ніж серед осіб із консолідованими переломами, і становила 37,7 проти 28,1 %.

2. Частка патологічних гомозигот 786­СС серед хворих із гіпопластичним та атрофічним типом хибного суглоба була вищою у 2,3 та 2,6 раза відповідно, ніж серед хворих із нормопластичним типом. Частота С­алелі при авітальних типах хибних суглобів сягала 41,7– 43,2 % порівняно з 29–31 % при вітальних типах.

3. Гомозиготні носії С­алелі переважали серед хворих із нейродистрофічним синдромом та рефрактурами. Серед хворих із генотипом eNOS 786­СС частіше виявлялись особи з аберантними рівнями ГЦ та маркерів запалення.