Журнал «Здоровье ребенка» 3 (46) 2013

Муковісцидоз — найбільш часте спадкове захворювання бронхолегеневої системи, що має велику медико­соціальну значимість у ряді розвинених країн, включаючи Україну. В останні роки відзначається зростання числа хворих із цією патологією, частота якої серед представників білої раси коливається від 1 : 600 до 1 : 12 000 новонароджених [11, 12]. При муковісцидозі ушкоджуються всі життєво важливі органи і системи, але тяжкість перебігу та прогноз захворювання у 90–95 % хворих визначають наявність хронічної інфекції та запалення дихальних шляхів [7, 13]. Акумуляція в бронхах в’язкого слизу і порушення мукоциліарного кліренсу сприяють розвитку та прогресуванню інфекційного процесу в дихальних шляхах [13].

Основну роль в етіології інфекційного процесу в бронхах, що ускладнює перебіг муковісцидозу, відіграють Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae та Pseudomonas aeruginosa. Наявність Ps.aeruginosa та спричинений нею запальний процес, боротьба з яким є досить складною проблемою у зв’язку з її резистентністю до фагоцитозу і до більшості антибактеріальних засобів, є прогностично несприятливою ознакою для пацієнта з муковісцидозом [10].

Поширеність хронічної інфекції Ps.aeruginosa при муковісцидозі за даними літератури становить від 25,8 до 48,9 % [15, 20]. Причини гіперчутливості хворих на муковісцидоз до цієї бактерії недостатньо вивчені. У деяких дослідженнях показано роль рецепторів дихального епітелію для Ps.aeruginosa як основа гіперчутливості хворих на муковісцидоз до хронічної інфекції [10]. Характерною рисою Ps.aeruginosa є гіпермутабельність, яка надзвичайно покращує її адаптацію до легеневого середовища та полегшує хронізацію процесу, що істотно погіршує функцію легенів [7]. Згідно з сучасною етіопатогенетичною концепцією, ураження легень при муковісцидозі в ушкодження легеневої тканини значний внесок робить надмірна імунна відповідь організму, а не тільки і не стільки пряма шкідлива дія мікробних агентів. Колонізація дихальних шляхів Ps.aeruginosa викликає виражену запальну відповідь, що супроводжується вивільненням великої кількості цитокінів, оксидантів, ензимів (протеази й еластази), які сприяють формуванню порочного кола запалення, що призводить у підсумку до пошкодження легеневої тканини [7].

Мета дослідження: дослідити фактори, що сприяють колонізації респіраторного тракту Ps.aeruginosa у дітей, хворих на муковісцидоз.

Матеріали та методи дослідження

Під нашим спостереженням знаходилося 37 дітей, хворих на муковісцидоз із панкреатичною недостатністю, віком від 3 до 15 років (середній вік становив 9,8 ± 0,5 року). Обов’язковий комплекс обстеження включав рентгенографію органів грудної клітки, дослідження загального аналізу крові, загального аналізу сечі, бактеріологічне дослідження харкотиння з визначенням чутливості до антибіотиків. Контрольну групу становили 30 здорових дітей, репрезентативних за віком та статтю.

Вміст протимікробних пептидів — a­дефен­зинів 1–3 (Human Neutrophil Peptides 1–3, HNP 1–3) у сироватці крові досліджували методом імуноферментного аналізу з використанням комерційного набору HNP 1–3 (ELISA, Bio Tech Lab­S). Дослідження рівня С­реактивного білка (СРБ) проводилося з використанням комерційного набору CRP (Elisa, DRG).

Визначення метаболітів оксиду азоту в крові проводили спектрофотометричним методом із попередньою депротеїнізацією сироватки й відновленням NO₃ до NO₂ [6]. Рівень iNOS визначали спектрофотометричним методом. Вміст NTproBNP вивчався методом ІФА з використанням тест­наборів Biomedica (Австрія).

Отримані результати опрацьовано методом варіаційної статистики з використанням пакета аналізу програми Statisticа for Windows 6.0 з обчисленням середнього арифметичного (М), середнього квадратичного відхилення (s) і середніх помилок (m), коефіцієнта варіації (Cv), коефіцієнта парної лінійної кореляції Пірсона (r). Для оцінки відмінностей показників у порівнюваних групах використовувався t­критерій Стьюдента. Відмінності вважали вірогідними при р < 0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

За результатами проведеного бактеріологічного дослідження харкотиння патогенну мікрофлору було виділено у 22 (59,4 %) хворих. Було встановлено, що домінуючою мікрофлорою виступала Ps.aeruginosa , що зустрічалася у 14 (37,8 %) пацієнтів. Слід відмітити, що монокультуру Ps.aeruginosa було виділено у 4 (10,8 %) обстежених, а у 10 (27,0 %) було виявлено мікст­інфікування дихальних шляхів, тобто Ps.aeruginosa в сполученні з H.influenzae або S.аureus. Інші збудники зустрічалися з такою частотою: H.haemolyticus — у 3 (8,1 %) хворих, S.аureus у монокультурі виділявся в 1 (2,7 %) пацієнта, H.influenzae — в 1 (2,7 %) хворого. У 3 (8,1 %) дітей було виявлено мікробну асоціацію H.influenzae із S.аureus. Крім того, у 3 (8,1 %) пацієнтів встановлено наявність грибково­бактеріальної асоціації. Таким чином, у дітей, хворих на муковісцидоз, характерною рисою виступала колонізація дихальних шляхів Ps.aeruginosa.

Беручи до уваги дані літератури, що свідчили про значну роль у формуванні антибактеріального захисту антимікробних пептидів, у тому числі a­дефензинів [30], ми дослідили вміст a­дефензинів 1–3 в сироватці крові дітей, хворих на муковісцидоз (табл. 1). За результатами проведеного дослідження було встановлено, що хворим на муковісцидоз притаманний надзвичайно високий рівень a­дефензинів 1–3 в сироватці крові, що в 3,9 раза перевищував показники контрольної групи. У сучасній літературі висловлюється думка про те, що високий рівень дефензинів у сироватці крові може служити маркером тяжкості перебігу захворювання та наявності легеневої дисфункції [23].

Маючи на увазі той факт, що колонізація нижніх дихальних шляхів Ps.aeruginosa  значно погіршує перебіг муковісцидозу у дітей, ми проаналізували вміст у сироватці крові a­дефензинів 1–3 з урахуванням стану мікробіоценозу дихальних шляхів, тобто за наявності (перша група) або відсутності (друга група) Ps.aeruginosa  (табл. 2). Проведений аналіз показав, що у дітей обох груп рівень a­дефензинів 1–3 в сироватці крові вірогідно перевищував показники, отримані в контролі. На цьому тлі ми звернули увагу на той факт, що наявність Ps.aeruginosa  супроводжувалася високим рівнем концентрації a­дефензинів 1–3 у сироватці крові дітей, хворих на муковісцидоз, у 6,8 раза (р < 0,001).

Поряд із дефензинами одним із найчутливіших та ранніх індикаторів запалення, викликаного бактеріальними інфекціями, виступає С­реактивний білок [25]. Основна біологічна функція СРБ, як і всіх білків гострої фази, — знищення збудників у вогнищах ураження та відновлення функціональних і структурних порушень [4]. У той же час згідно з численними проспективними дослідженнями, підвищення рівня СРБ у поєднанні з високим вмістом a­дефензинів маркером розвитку ендотеліальної дисфункції [5, 21].

За результатами дослідження вмісту СРБ у сироватці крові дітей, хворих на муковісцидоз (табл. 1), було встановлено, що їм притаманне триразове зростання рівня означеного пептиду в сироватці крові, р < 0,01. Проведений додатково аналіз вмісту СРБ, із урахуванням особливостей колонізації дихальних шляхів, тобто за наявності (перша група) або відсутності (друга група) Ps.aeruginosa (табл. 2) показав, що надзвичайно високе (р < 0,001) значення СРБ зафіксовано за наявності Ps.aeruginosa, у той час як у дітей другої групи рівень СРБ у сироватці крові залишався в межах контрольних показників (р > 0,02).

Отримані результати виглядають логічними, якщо взяти до уваги літературні дані, які вказували, що патогенна дія Ps.aeruginosa зумовлена вивільненням ендотоксинів та хемоатрактантів при загибелі та розпаді бактеріальної клітини. Високий рівень хемоатрактантів і прозапальних цитокінів у дихальних шляхах при муковісцидозі сприяє накопиченню активованих нейтрофілів, які гинуть, звільняючи ДНК і волокнистий актин, що призводить до збільшення в’язкості харкотиння та зниження антибактеріальної активності антимікробних пептидів. Таким чином, виявлене різке зростання рівня a­дефензинів 1–3 виступало компенсаторно­адаптаційною реакцією, спрямованою на подолання контамінації патогену [17, 18]. Разом із тим на сучасному етапі доведено, що високі рівні a­дефензинів індукують вивільнення інтерлейкіну­8 та нейтрофіл­активуючого білка 78 із епітеліальних клітин дихальних шляхів, що призводить до додаткової міграції поліморфноядерних лейкоцитів у вогнище запалення [2, 27]. Надлишкова акумуляція нейтрофілів в паренхімі легень та капілярах, у свою чергу, сприяє формуванню локального «протеазного вибуху» з ушкодженням компонентів сурфактанту, базальної мембрани альвеол, ендотеліоцитів. Крім того, a­дефензини 1–3 у високій концентрації підвищують проникність мікроциркуляторного русла як прямо, так і шляхом стимуляції дегрануляції тучних клітин. [2, 8, 24]. Тобто за таких умов компенсаторно­адаптаційна реакція, спрямована на подолання контамінації патогену, набуває характеру патологічної і виступає додатковим фактором ураження дихальної системи.

Необхідно відзначити, що високі концентрації дефензинів інгібують фагоцитарну активність нейтрофілів. Застосування Са²⁺­блокаторів або a1­інгібітору протеїназ запобігає розвитку дефензин­індукованої фагоцитарної недостатності [19, 29]. Таким чином, у хворих на муковісцидоз відзначається різко підвищена продукція дефензинів, що, цілком імовірно, індукована бактеріальними агентами. Однак дана суперпродукція дефензинів обумовлює інгібування фагоцитозу поліморфноядерними лейкоцитами, що призводить до виникнення некурабельних або малокурабельних форм перебігу інфекційного процесу респіраторного тракту, викликаному Ps.aeruginosa. Розробка медикаментозних методів, спрямованих на запобігання інгібуючій фагоцитоз дії дефензинів, може відкрити нові напрямки лікування хворих із муковісцидозом.

Відомо, що оксид азоту виступає фактором, який бере участь в антимікробному захисті мікроорганізму. Дія оксиду азоту спричиняє загибель багатьох типів мікроорганізмів або зупиняє їх ріст та розмноження, за що її назвали караючим мечем імунної системи. У реалізації цієї системи виділено два феномени — апоптотичну загибель клітин­носіїв та створення несприятливих умов для розмноження мікроорганізмів і виділення токсичних для патогену субстанцій. В основі антимікробної дії NO лежить здатність реактивних проміжних продуктів оксиду азоту викликати нітрозилювання та дезамінування білків, окислювальне ураження та порушення системи репарації ДНК. Крім прямої антимікробної дії NO бере участь у механізмах запалення. Розвиток означеного процесу має двофазний характер, при цьому кожна фаза асоційована з певними лізоформами NO­синтази. У ранню фазу відбувається стимуляція продукції оксиду азоту за допомогою нейрональної NO­синтази. Паралельно відбувається посилення продукції NO за рахунок ендотеліальної ізоформи NOS. Відбувається релаксація судин та їх посилення проникності. Пізня фаза запалення пов’язана з локальною лейкоцитарною активністю та інфільтрацією. До її розвитку робить внесок лише NO, який продукується за допомогою іNOS, що локалізована в лейкоцитах [14].

У зв’язку з вищенаведеним нами досліджено вміст метаболітів оксиду азоту в сироватці крові у дітей, хворих на муковісцидоз. Відомо, що у фізіо­логічних умовах переважає вивільнення факторів розслаблення, до яких належить оксид азоту [3]. Проведене оцінювання одержаних даних (табл. 1) показало, що в пацієнтів із муковісцидозом мало місце вірогідне (p < 0,05) зниження генерації оксиду азоту, яке не залежало від мікробного пейзажу дихальних шляхів (табл. 2). Одержані дані можуть виступати свідченням декількох процесів, що паралельно відбувалися в дітей із групи спостереження. Тобто, з одного боку, спостерігалося погіршення рівня антимікробного захисту, з іншого — вочевидь формувалися умови розвитку ендотеліальної дисфункції. Слід зазначити, що наявність в мікробіоті дихальних шляхів Ps.aeruginosa сприяла порушенню адекватного перебігу другої фази запалення за рахунок відсутності адекватної активації іNOS (табл. 2) і, як наслідок, зменшення продукції ендотеліального оксиду азоту. На цьому тлі у дітей другої групи рівень іNOS удвічі перевищував показники конт­рольної групи.

Наступним етапом нашої роботи було вивчення вмісту в сироватці крові натрійуретичного пептиду (NTproBNP) — гормону, біологічна дія якого багатогранна і реалізується, у тому числі, за рахунок вивільнення оксиду азоту [1, 26]. Натрійуретичний пептид поряд із антимікробними пептидами виявляє активність щодо грампозитивних та грамнегативних бактерій, а також дріжджів [9, 22]. У той же час згідно з експериментальними дослідженнями W. Veron еt al. (2007), Ps.aeruginosa має на своїй поверхні нуклеотидзалежну BNP­сенсорну систему, унаслідок чого при взаємодії натрійуретичного пептиду з мікроорганізмом активується синтез бактеріальної цАМФ та ліпополісахаридів. Даний процес призводить до посилення продукції факторів вірулентності Ps.aeruginosa і більш агресивного ушкодження клітин макроорганізму [28], за рахунок чого формується безперервний цикл запалення, що призводить до перебудови легеневої тканини та суттєво погіршує перебіг бронхолегеневого процесу.

Аналіз умісту NTproBNP у сироватці крові дітей, хворих на муковісцидоз, показав, що його рівень вірогідно (р < 0,05) перевищував показники контрольної групи. Разом із тим ми звернули увагу на результати індивідуального аналізу, спрямованого на визначення вмісту пептиду в основній групі дітей. Вміст NTproBNP у сироватці крові дітей означеної групи коливався в широкому діапазоні — від 180 до 800 фмоль/л, а коефіцієнт варіації (Cv) показника, що вивчався, становив 36,5 %, тобто група була неоднорідна. У зв’язку з цим ми дослідили вміст NTproBNP у сироватці крові залежно від наявності інфікування Ps.aeruginosa (табл. 2).

За результатами проведеного аналізу встановлено, що колонізація нижніх дихальних шляхів Ps.аuregenosa супроводжувалася підвищенням рівня натрійуретичного пептиду в 1,7 раза (р < 0,05). У той же час у групі пацієнтів, у яких було відсутнє інфікування Ps.aeruginosa, вміст NTproBNP не перевищував показники контрольної групи (p > 0,05). Таким чином, рівень NTproBNP у сироватці крові дітей, хворих на муковісцидоз та інфікованих Ps.aeruginosa, є компенсаторною реакцією у відповідь на розвиток вазоконстрикції на тлі ендотеліальної дисфункції і віддзеркалює розвиток серцево­судинних порушень із іншого боку, базуючись на вищенаведених даних [28], неможливо категорично відкидати той факт, що підвищення рівня NTproBNP сприяє погіршенню перебігу хронічного бронхолегеневого процесу за рахунок стимуляції агресії Ps.aeruginosa.

На підставі отриманих даних ми припускаємо, що процес елімінації інфекційних агентів у хворих на муковісцидоз супроводжується коактивацією таких неспецифічних механізмів, які в умовах нормального функціонування трансмембранного регулюючого протеїну муковісцидозу не беруть участі в захисті респіраторного тракту від інфекційних агентів. Разом із тим індукція даних механізмів, зокрема посилення продукції NTproBNP, може стати патогенетичним фактором, що визначає розвиток легеневої гіпертензії у хворих на муковісцидоз. На нашу думку, визначення рівня концентрації в сироватці крові метаболітів оксиду азоту і NTproBNP дасть можливість оцінити індивідуальний ризик розвитку легеневої гіпертензії у хворих на муковісцидоз [16]. Необхідні подальші дослідження, спрямовані на визначення конкретного прогностичного внеску зменшення продукції ендотеліального оксиду азоту і зростання синтезу та вивільнення NTproBNP, щодо вірогідності розвитку легеневої гіпертензії у хворих на муковісцидоз.

Висновки

1. Дітям, хворим на муковісцидоз, притаманне підвищення вмісту в плазмі крові a­дефензинів 1–3. Продукція HNP 1–3 адаптивно підвищувалася у відповідь на контамінацію дихальних шляхів Ps.aeruginosa, однак високі концентрації дефензинів пригнічували фагоцитарну активність нейтрофілів. За таких умов компенсаторно­адаптаційна реакція, спрямована на подолання контамінації патогену, набувала характеру патологічної і виступала додатковим фактором ураження дихальної системи.

2. У хворих на муковісцидоз відбувалося зниження генерації оксиду азоту, що не залежало від мікробного пейзажу дихальних шляхів. Наявність у мікробіоті дихальних шляхів Ps.aeruginosa сприяла порушенню адекватного перебігу другої фази запалення за рахунок відсутності адекватної активації іNOS.

3. Підвищення рівня NTproBNP у сироватці крові дітей, хворих на муковісцидоз, ускладнений Ps.aeruginosa, є компенсаторною реакцією у відповідь на зниження генерації оксиду азоту, і не виключено, що воно виступає додатковим фактором підтримки хронічного запалення та ураження дихальної системи.