Журнал «Здоровье ребенка» 7 (50) 2013

Введение

В течение века проводятся исследования и эксперименты по выявлению причин и механизмов формирования легочной гипертензии (ЛГ). Вместе с тем до сих пор остаются открытыми некоторые аспекты легочной гемодинамики у детей с бронхолегочной дисплазией (БЛД). Не выяснены особенности легочной циркуляции у детей, рожденных в саккулярную стадию, обсуждается возможность роста и восстановления легочного русла в раннем детском возрасте, предикторы формирования хронического легочного сердца. В статье представлены особенности эмбрионального и фетального периодов формирования легочных сосудов, внутриутробная и внеутробная регуляция тонуса, этиология и механизмы развития легочной гипертензии у детей с бронхолегочной дисплазией, а также проведены оригинальные исследования факторов неоваскуляризации, фиброза и вазодилатации у детей с БЛД.

Известно, что пульмональная циркуляция формируется параллельно альвеоляризации [7]. Васкуляризация происходит за счет интеграции эндотелия, мезенхимы и эпителия, окружающих бронхиальные почки, в условиях низкого рО₂ (в сравнении с постнатальным периодом) и зависит от протеинов экстрацеллюлярного матрикса, а также передающих интергиновых рецепторов. С помощью электронной микроскопии в эмбриональном периоде были выявлены примитивные эндотелиальные клетки — предшественники сосудистого эндотелия. Клетки висцеральной мезодермы становились ангиобластами и выстраивались в экстрацеллюлярном матриксе как координирующие клетки (cord-like-клетки). Отмечено, что ангиобласт продуцировал первую генерацию эндотелиальных клеток, не имеющих специфичности. Дочерние клетки ангиобласта имели особенности артериального или венозного отрезка циркуляции. Сord-like-клетки образовывали крупные сосуды за счет комплектования клеток мышц и эндотелия артериальной стенки и формировали капиллярную сеть. Кроме васкулогенеза, cord-like-клетки также координировали рост альвеол [7]. В настоящее время выясняется роль матриксного протеина, рецепторов, факторов промоции, дифференциации и роста в ангиогенезе. Так, меняется концепция пульмональной циркуляции у взрослых с акцентом на особенности ангиогенеза в период внутриутробного развития. Остается открытым вопрос, как клетки выстраиваются и формируют различные функции.

Известно, что формирование сосудов происходит с началом экспрессии примордиальными эндотелиальными клетками бронхиальных почек фетальной печеночной киназы (flk-1) с активацией VEGF [3]. Cord-like эндотелиальные клетки начинают формировать трубку и окружающие кровяные островки. В результате формируется подобие микрососудов. В человеческом эмбрионе с 50-го дня гестации начинается канализация с подходом сосудов из венозного синуса к капиллярам. Около 10 недель формируется примитивная капиллярная сеть и возникает контакт между сетью и венами возле дистальных отделов бронхиальных почек. Затем формируется сосудистая сеть, аккомпанирующая альвеолам. Так, сосуды растут в определенном порядке: капилляры — пульмональные вены — просвет вен — соединение вен с капиллярами — канализация бронхиальных и пульмональных артерий — их соединение с капиллярной сетью. В результате на 19-й неделе капиллярная сеть становится частью альвеолярной стенки, формируя альвеолокапиллярную мембрану [1, 4]. Матриксные протеины обеспечивают связь между мезенхимальными, эпителиальными и эндотелиальными клетками. Эта связь настолько сильна, что легочная мезенхима без эндотелиальных клеток дегенерирует.

При повреждении клетки сосуда быстро восстанавливаются, а при восстановлении растут анатомически правильно независимо от характера митогена. Ремоделирование сосудов в эмбриональном периоде происходит за счет мышечных клеток сосуда, схожих с эмбрио­нальными [5]. Только внутриутробно возможен рост за счет неоинтимы и медии. После рождения — за счет медии. Пополнение 80 % пула клеток происходит каждые 24 часа. После рождения репликация становится значительно медленнее. Протеины базальной мембраны и матриксные металлопротеиназы играют важную деградирующую и проростовую роль. Доказано, что внутриутробные некоординированные сигналы могут замедлять рост альвеолярного пространства, удерживая нарушение проницаемости альвеолокапиллярной мембраны после рождения. Малые дозы никотина во время беременности индуцируют легочную гипоплазию с абнормальным развитием циркуляции.

К концу первой половины беременности примитивные бронхи с сосудами и ветками дыхательных путей уже сформированы. С 18-й до 26-й недели гестации альвеолярное пространство увеличивается экспотенциально. В фетальном периоде значительно увеличивается количество генераций артериол (с 5–6 до 40 разветвлений), а легочный объем сосудов увеличивается вдесятеро. Контакт альвеол для обмена происходит на 18–20-й неделе. Для выяснения легочной циркуляции в последние недели беременности исследовано 200 новорожденных с 20–40-й недели гестации. Так, при ультрасонографии объем правой камеры сердца увеличивался на 60 %, а объем крови — на 8 %. Легочный объем повышался быстрее, чем давление в легочных сосудах. У недоношенных отличалось также строение супернуменарных артериол: их было в 3–4 раза больше, и они имели клапан, а также были более чувствительны к NO, 5-гидрокситриптамину, цГМФ и менее — к тромбоксану [5].

Супернуменарные артерии играют важную роль в легочной циркуляции, особенно в последних стадиях фетального развития. Супернуменарные артерии отходят от артерий бронхов и покидают верхушку ацинуса. Затем они попадают в паренхиму, распадаясь на мелкие сосуды, и открываются в капиллярную сеть легких. Супернуменарные артерии являются провод­ником между эпителием бронхов и альвеолярными септами. Так, супернуменарные — независимый проводник из начала ацинуса.

Рост сосудов зависит от нормальной оксигенации. При низкой оксигенации возникает торможение роста. Гипоксическая пульмональная вазоконстрикция описывается у новорожденных 30–36 недель гестации. Наиболее очевидная субстанция, которая контролирует фетальную легочную циркуляцию, — давление в легочной артерии (рЛА). Низкое давление в легочной артерии поддерживается высоким артериальным тонусом легочных артерий, необходимым внутриутробно. После рождения высокое артериальное давление снижается за счет снижения тонуса сосудов. В исследованиях J. Rasanen доказано увеличение объема крови в пульмональной артерии у плода 31–36 недель, уменьшение потока по артериальному протоку и овальному окну при вдыхании матерью высокооксигенированной смеси [5]. У плодов 20–26 недель гестации данные изменения не происходили. На основании этого сделаны выводы, что фетальная кислородозависимая регуляция легочной циркуляции развивается с 31-й недели гестации. Фетальные механизмы пульмонального васкулярного контроля, такие как NO и калиевые ионные каналы, также отличаются от внеутробных. Высокое давление кислорода в фетальных легких активирует кальцийчувствительные калиевые каналы (К_Са) и позволяет калиевым ионам вытекать из клеток гладкой мускулатуры, что способствует вазодилатации. Хотя К_Са-каналы являются медиаторами, вазодилатации способствует NO, синтезирующийся медиаторами эндотелия. В более поздние сроки гестации синтез NO обеспечивается гладкой мускулатурой (рис. 1).

NO — самый мощный вазодилататор. В эндотелиальных клетках существуют энзимы нитритоксидсинтазы (eNOS), которые катализируют продукцию эндотелиальными клетками NO, конвертируя кислоту амниона, L-аргинин (L-arg), в цитрулин. NO продуцируется эндотелиальными клетками, легко проходит в медию, вызывая релаксацию гладкой мускулатуры сосудов. МРНК для eNOS появляется в легочных артериях овец в последние дни первой половины гестации и играет важную роль в фетальном легочном вазомоторном контроле. Сигнал от мРНК к eNOS и активация появляются в последние дни беременности. Более того, eNOS контролирует нормальное васкулярное развитие [5].

Доказана взаимосвязь рО₂ с вазодилатацией через NO. Кислород активирует NO в эндотелии, однако эффект его краткосрочен. При опытах с острой гипероксией выявлено 2-кратное увеличение потока крови и резистентности сосудов. Однако через 2 часа поток и резистентность возвращаются к прежним параметрам.

Транзиторная вазодилатация обусловлена ацетилхолином. Усиливается эффект цГМФ (расслабление гладкой мускулатуры сосудов) и другими эндотелиальнозависимыми вазодилататорами, такими как гистамин, брадикинин, толазолин. Вазодилататоры способствуют закрытию артериального протока через активацию эндотелиальных факторов.

Еще один важный вазодилататор — эндотелин-1, пептид, который регулируется через эндотелин-А-рецепторы (ЕТа) (вазоконстрикторы) или эндотелин-В-рецепторы (ЕТв) (вазодилататоры). Рецепторы расположены по ходу легочных капилляров. Максимальное количество достигается к рождению. При исследовании эндотелиновых рецепторов у плодов блокада ЕТа-рецепторов индуцирует вазодилатацию, а ЕТв-рецепторов — не имеет эффекта. На основании этого исследователи предполагают, что баланс рецепторов в фетальном периоде направлен в сторону вазоконстрикции. ЕТа-рецепторы выявляются в ранние сроки, увеличение ЕТв-рецепторов происходит в поздние сроки гестации. Обнаружена редукция рецепторов ЕТв эндотелина после рождения у детей с ЛГ. Постоянная блокада ЕТв-рецепторов способствует повышению уровня эндотелина-1 [5].

В ходе изучения патогенеза легочной гипертензии была проведена острая внутриутробная компрессия артериального протока овцам. При этом увеличивался выброс из правого желудочка, немедленно увеличивалось давление в правом желудочке, активировались эндотелиальнозависимые механизмы вазодилатации. Данные изменения сохранялись около 2 часов. Назначение кислорода при острой компрессии вызывало длительную вазодилатацию. При хронической компрессии артериального протока в течение 9–14 дней и последующем назначении кислорода матери вазодилатирующего эффекта выявлено не было. И более того, достаточная вазодилатация не происходила вплоть до рождения. Гипоксемия выявлялась, несмотря на вентиляцию матери 100% кислородом. Ягнята, рожденные после дуктальной компрессии внутриутробно, несколько дней сохраняли ЛГ, гипо­ксию, низкое давление в легких. Инфузия ацетилхолина, эндотелиальнозависимых вазодилататоров недостаточно уменьшала ЛГ, сохранялась резистентность гипоксемии. Введение эндотелиальнонезависимых вазодилататоров (натрийуретический пептид) и добавление NO в дыхательные пути дилатировали легочную артерию. Таким образом, выявлена активация эндотелиальных факторов без вазодилатации и также важная роль эндотелия в тонусе легочных сосудов. Большая способность к вазоконстрикции сохранялась и после рождения, способность к вазодилатации была недостаточной.

Таким образом, состояние эндотелия — ключ к ЛГ. Фетальная артериальная стенка имеет огромные способности к репликации, что обусловлено наличием специфического изоэнзима протеинкиназы С (РКС), который имеет место в фетальном периоде и исчезает или уменьшается у взрослых. Фетальные мышечные клетки и фибробласты демонстрируют более выраженную репликацию на гипоксию, чем клетки взрослых, а сосудистая стенка хуже откликается на экзогенные митогены. В фетальной сосудистой стенке выше апоптоз и метаболизм матрикса, а гладкомышечные клетки полифункциональны. Особенностью матриксного внутриутробного синтеза является более выраженная стимуляция фибронектина, эластина с продолжением абнормального стимула в неонатальный период, и повышенной чувствительностью к стимуляции в раннем детском возрасте. Недоношенные более значительно реагируют вазоконстрикцией на гипоксемию, а легочная гипертензия сохраняется еще в течение длительного времени после низкого рО₂. Высокое давление в ЛА более быстро, чем у взрослых, вызывает констрикцию сосудистой стенки, включая пролиферацию фибробластов, синтез соединительной ткани, активацию цитокинов и митогенов, матриксного протеина и трансформацию в фибробласты, которые откладываются на протяжении пульмональной артерии. Хроническая гипоксия способствует запуску длительного фиброзирования. Кроме того, любое повреждение сосудистой стенки артерии в последующем еще более активирует выброс фибробластов, способствует неомускулинизации сосудов и увеличению медии.

Данные, представленные выше, доказывают необходимость изучения тонуса сосудов у детей с бронхолегочной дисплазией, родившихся раньше срока и находившихся под влиянием факторов, способствующих внутриутробному торможению роста сосудистой стенки и механизмов регуляции сосудистого тонуса.

Цель: усовершенствование диагностики причин и механизмов формирования легочной гипертензии у детей с бронхолегочной дисплазией путем изучения возрастной динамики VEGF, TGF-₁и цГМФ, а также их взаимосвязи с гипоксией и кислотно-щелочным состоянием крови и давлением в легочной артерии.

Материалы и методы

Обследовано 82 ребенка в возрасте 1–36 месяцев с бронхолегочной дисплазией (основная группа), находившихся в центре диагностики и лечения бронхолегочной дисплазии, за период 2007–2013 гг. Диагноз «бронхолегочная дисплазия» был установлен согласно международной классификации болезней X пересмотра. В качестве группы сравнения наблюдались 24 ребенка в возрасте 1–36 месяцев, которые были рождены недоношенными, имели респираторные расстройства, но не сформировали бронхолегочную дисплазию. Обследованные были рождены в разные сроки гестации. Для рандомизации выборки вычислялся корригированный возраст по формуле: А(к) = –40 + (А(г) + А(п)) / 4, где А(к) — корригированный возраст; А(г) — гестационный возраст в неделях; А(п) — паспортный возраст в неделях. Сатурация кислорода определялась с помощью пульсоксиметрии (аппарат «ЮТАСОКСИ-201»). Кислотно-основное состояние крови анализировалось с помощью анализатора газов крови АВL-5. Давление в ЛА определялось с помощью эхокардиографии с допплеровским эффектом. Ростовые факторы (VEGFи TGF-₁) определялись методом иммуноферментного анализа (ИФА) сыворотки крови, цГМФ индуцированной мокроты — методом ИФА после индукции 3% NaCl. Проведена статистическая обработка данных методом непараметрической статистики: определена медиана и квартили, достоверность — по методу Колмогорова — Смирнова, корреляция — по методике Спирмена.

Результаты и их обсуждение

У детей с бронхолегочной дисплазией выявлено достоверное повышение TGF-₁ в сыворотке крови во всех возрастных группах (р < 0,05) (табл. 1), что свидетельствует в пользу активации фиброзирования и торможения онтогенеза легких на протяжении первых 3 лет жизни, с отсутствием тенденции к снижению TGF-₁ к трем годам жизни. Причем отмечается некоторый рост данного показателя на 3-м году жизни.

Выявлена зависимость между TGF-₁ и показателями SatO₂, рСО₂, давления в легочной артерии (табл. 2). Данные позволяют сделать вывод о прямой достоверной зависимости активации фиброза и торможения онтогенеза легких от повышенного давления в легочной артерии. Таким образом, повышенное давление в легочной артерии можно считать предиктором неблагоприятного исхода бронхолегочной дисплазии с формированием пневмофиброза. Сниженная SatO₂, вероятно, активирует фетальные мышечные клетки и фибробласты, что подтверждается достоверной зависимостью от TGF-₁ (р < 0,05).

Высокая активность TGF-₁ нами рассматривается как результат гипоксии, учитывая возможность длительного сохранения направленности эндотелия на фиброз и вазоконстрикцию после перманентных эпизодов гипоксии. Данные требуют дальнейшего изучения для выявления сроков сохранения вазоконстрикции у детей с БЛД после гипоксии и влияния на обструкцию сосудистого русла кислородзависимых и эндотелийзависимых механизмов.

Сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF был ниже у детей с БЛД. Показатели снижались достоверно со 2-го года жизни в основной группе (р < 0,05). Мы расценивали данные как торможение сord-like рецепторами активации VEGF, а следовательно, и роста сосудов на протяжении первых трех лет жизни у детей с бронхолегочной дисплазией. При проведении корреляции уровня сосудистого эндотелиального фактора роста с уровнем давления в легочной артерии также выявлены достоверные связи (р < 0,05). Таким образом, повышенное давление в легочной артерии тормозило рост сосудов легких. Учитывая данные литературы о склонности к преобладанию вазоконстрикции у недоношенных детей, можно сделать вывод, что замедление ангиогенеза снижало объем легочного сосудистого русла, повышало давление в легочных сосудах и способствовало нарушению матриксного синтеза.

Уровень цГМФ мокроты, мощного вазодилататора, был значительно повышен во всех возрастных группах (табл. 1) и наиболее достоверно коррелировал с высоким давлением в легочной артерии. На основании этого можно думать о гиперактивации сосудистых эндотелийзависимых факторов вазодилатации в ответ на повышение давления в легочном русле у детей с бронхолегочной дисплазией. Отсутствие существенного снижения давления в ответ на вазодилататоры позволяет предположить несовершенство рецепторов вазодилатации у данной категории детей. Гипоксия и гиперкапния также влияли на уровень цГМФ в мокроте (р < 0,05). Причем имелась достоверно отрицательная зависимость кислорода от уровня цГМФ, на основании чего можно говорить о стимуляции вазодилатации у детей с БЛД повышенным давлением кислорода и наоборот.

Выводы

У детей с бронхолегочной дисплазией отмечалось достоверное повышение TGF₁ (р < 0,05) и цГМФ (р < 0,01–0,001), снижение VEGF (р < 0,05), свидетельствующие о торможении ангиогенеза, активации фиброза и эндотелийзависимых факторов вазодилатации с 1-го до 36-го месяца корригированного возраста. Выявлена достоверная прямая зависимость активации TGF-₁ крови и цГМФ мокроты, а также обратная корреляция VEGF крови и рЛА. Таким образом, легочная гипертензия является неблагоприятным фактором активации фиброза и торможения ангиогенеза у детей с БЛД. Снижение сатурации и парциального давления кислорода умеренно активировало цГМФ, однако цГМФ у детей с БЛД не обеспечивал достаточного снижения давления в легочной артерии.