Журнал «Здоровье ребенка» 2 (61) 2015

Статья опубликована на с. 202-207

Активация NOX

Активация НАДФH-оксидазы

Механизмы рецептор-ассоциированной активации НАДФH-оксидаз (NOX2) наиболее изучены у фагоцитирующих клеток, у которых во время фагоцитоза наблюдается усиленная продукция активированных кислородных метаболитов (АКМ) [3–5, 7, 8]. Основными стимулирующими факторами механизмов активации НАДФH-оксидазы являются цитокины — TGF-β₁, TNF-α и IL-1β, пептидные факторы роста (PDGF; EGF, VEGF, bFGF и инсулин), патоген-ассоциированные молекулярные структуры (РАМР) инфекционных агентов, активирующие Toll-подобные рецепторы (TLR), агонисты G-протеин-связанных рецепторов (GPCR — G-protein-coupled receptors) — ангиотензин II, тромбин, эндотелин-1, серотонин, лизофосфатидиновая кислота, 1-фосфат сфингозина, гистамин, брадикинин. РАМР, в частности флагеллин Pseudomonas aeruginosa, могут взаимодействовать и с рецептором P_2Y, что ведет к высвобождению АТФ, которая индуцирует активность НАДФН-оксидазы [14, 23]. НАДФH-оксидаза в нефагоцитирующих клетках активируется лигандами GPCR, некоторыми интерлейкинами и клеточными факторами роста [18].

Инициализация процесса сборки НАДФH-оксидазы в фагоцитирующих клетках связана с двумя внутриклеточными сигнальными факторами — с активностью фосфоинозитол-3-киназы (PI3K) и с повышением внутриклеточной концентрации ионов Са²⁺. Активация PI3K обусловливает фосфорилирование протеина Rac, что способствует его перемещению к внутренней поверхности цитоплазматической мембраны клетки [7, 17]. Повышение внутриклеточной концентрации ионов Са²⁺ индуцирует кальцийзависимую протеинкиназу С_б (РКС_б), которая обусловливает фосфорилирование цитоплазматической фосфолипазы А₂ (PLA₂). Цитоплазматическая PLA₂ из фосфатидилхолина высвобождает свободную арахидоновую кислоту, дальнейшая метаболизация которой представлена липооксигеназным и циклооксигеназным вариантами. Под влиянием 5-липоксигеназы из арахидоновой кислоты образуется гидропероксиэйкозатетраеновая кислота (HPETE), которая преобразуется в лейкотриены, эпоксилины, липоксины и гидроксиэйкозатетраеновую кислоту (HETE). При участии циклооксигеназ (COX₁, COX₂) арахидоновая кислота метаболизируется до эндопероксида PGG₂, из которого в дальнейшем образуются гидроксигептадекатриеновая кислота (ННТ), простагландины (ПГЕ₂, ПГF_2, ПГI₂, ПГD₂), тромбоксан А₂. Цитоплазматическая PLA₂, свободная арахидоновая кислота и ее дериваты инициализируют ключевой процесс каскада активации НАДФH-оксидазы — фосфорилирование цитоплазматических p47^phox и p67^phox [26]. В процесс фосфорилирования субъединиц p47^phox и p67^phox НАДФH-оксидазы также вовлечены несколько других киназ — p38-активированная протеинкиназа, p21-активированная киназа (PAK), казеиновая киназа-2, протеинкиназа-B. Однако среди этого множества киназ доминирующую роль в процессе активации субъединиц НАДФH-оксидазы играет РКС. Вызванные фосфорилированием конформационные изменения молекулы p47^phox обусловливают перемещение цитоплазматически расположенного комплекса p47^phox/p67^phox к внутренней поверхности мембраны клетки [12, 15] с одновременной транслокацией p40^phox и Rac [7].

Активация НАДФH-оксидазы в фагоцитирующих клетках происходит при взаимодействии комплекса p47^phox/p67^phox/p40^phox и Rac с мембрано-ассоциированным цитохромом Cytb₅₅₈. Предполагают, что фосфорилирование аминокислотных остатков Ser³⁰³, Ser³⁰⁴ и Ser³²⁸ протеина p47^phox обусловливает взаимодействие комплекса p47^phox/p67^phox/p40^phox с богатыми пролиновыми аминокислотными остатками областями эндоплазматического хвоста субъединицы p22^phox мембранного Cyt_b558, что обусловливает формирование активного ферментного комплекса (рис. 1) [19].

Регуляция ферментативной активности НАДФH-оксидазы достигается двумя механизмами: пространственным разъединением субъединиц фермента и модуляциями протеин-протеиновых и протеин-липидных взаимодействий [7, 15].

Активация других протеинов семейства NOX

Ферменты NOX нефагоцитирующих клеток активируются лигандами GPCR, некоторыми интерлейкинами и клеточными факторами роста [18]. Процесс активации протеинов семейства NOX нефагоцитирующих клеток отличается от активации НАДФН-оксидазы некоторыми особенностями (рис. 2).

По всей вероятности, генерируемый разными NOX O₂^– выполняет различные функции. АКМ, генерируемые протеинами семейства NOX, оказывают действие как внутри клетки, так и во внеклеточном пространстве. Протеины NOX2 и DUOX1/2 генерируют АКМ во внеклеточное пространство, где они оказывают преимущественно бактерицидное действие. Другие представители семейства NOX генерируют АКМ преимущественно внутрь клетки, таким образом регулируя различные функции клетки (рис. 3) [9]. Так, внутриклеточно генерируемые АКМ ингибируют активность фосфатаз, активируют деятельность киназ (р38 MAPK), регулируют функцию ионных каналов, кальций-зависимое возбуждение, экспрессию генов некоторых протеинов (TNF-α, TGF-β₁, ангиотензина II, моноцитарного хемоаттрактантного протеина-1, ингибитора активатора плазминогена-1) [6].

Функциональная активность протеинов NOX предопределяет развитие разных патологических процессов (рис. 4).

Генерация АКМ

Активная, полностью собранная НАДФH-оксидаза осуществляет перенос одного электрона на молекулярный кислород. Электроны передаются от первичного электронного донора НАДФH (со средним потенциалом 320 мВ, в частности для NOX2) вдоль электрохимического градиента — ФАД → 2 гема → O₂ (средний потенциал 160 мВ). Электрохимический градиент от НАДФH к O₂, составляющий 160 мВ, постоянно обеспечивает движение электронного потока с внутренней стороны на внешнюю сторону мембраны [11]. НАДФH-оксидаза генерирует короткоживущий (с периодом полураспада в несколько 10^–6 секунд) O₂^–, который без участия ферментов или под влиянием супероксиддисмутаз (SOD) дисмутирует до перекиси водорода (H₂O₂) с последующей организацией как гидроксильного радикала (OH^•), так и, в результате действия каталазы, кислорода (O₂) и воды (H₂O) (рис. 5) [10, 25].

Основной активной формой кислорода является O₂^–, который образуется при переносе одного электрона к молекуле кислорода. Супероксидный анион-радикал может действовать как окислитель и как восстановитель. Супероксидный анион-радикал характеризуется низкой реактивностью по отношению к биоорганическим субстратам. Ключевыми субстратами O₂^– являются протеины, содержащие железо-серные кластеры. Он активно взаимодействует с цитохромом C, супероксиддисмутазами, аскорбиновой кислотой. И не реагирует с полиненасыщенными жирными кислотами. Однако O₂^– участвует в реакциях, в результате которых образуются значительно более активные радикальные дериваты кислорода: гидропероксидный и гидроксильный радикал [20].

Двухэлектронный перенос обусловливает образование умеренной по окислительной активности H₂O₂, трехэлектронный перенос — образование сильного окислителя гидроксильного радикала, который участвует в процессе окисления различных структур клетки [10, 25]. Критически важными являются количественные аспекты окислительно-восстановительных систем. Так, скорость потребления О₂ в организме человека составляет около 0,4 л/мин, но может быть увеличена практически в 10 раз — до максимального значения 4 л/мин. От одного до четырех процентов от объема O₂ в митохондриях превращается в H₂O₂, то есть скорость образования H₂O₂ составляет от 5000 до 20 000 мкмоль/кг^–1/мин^–1. Фактическая скорость генерации H₂O₂ значительно больше, так как в ее образовании участвуют и другие генераторы — оксидазы. Было показано, что до 10 % O₂ может быть преобразовано в H₂O₂ [16]. Перекись водорода при взаимодействии с ионами железа или меди разлагается с образованием крайне реакционно-способного гидроксильного радикала по реакции Фентона: H₂O₂ + Fe²⁺ → HO^• + OH^– + Fe³⁺. Этим объясняется опосредованное цитотоксическое действие H₂O₂. Долгое время считалось, что вторым путем образования гидроксильного радикала может быть реакция Хабера — Вайса: H₂O₂ + O₂^–• → HO^• + O₂ + OH^–. Однако в физиологических условиях реакция Хабера — Вайса представляет собой сумму реакций Фентона и восстановления ионов Fe³⁺ супероксид-анион-радикалом. Генерация гидроксильного радикала возможна и при восстановлении Н₂О₂ переносчиком электрон-транспортной цепи митохондрий ферредоксином. Гидроксильный радикал ОН^• является самым мощным окислителем из всех форм АКМ. Он может окислять практически все низкомолекулярные органические молекулы, белки и нуклеиновые кислоты. Гидроксильный радикал способен отрывать атом водорода от молекул ненасыщенных жирных кислот и инициировать перекисное окисление липидов. Однако эти реакции строго локализованы, так как гидроксильный радикал — крайне нестабильная молекулярная форма (время жизни 10^–9 секунд), и потому он реагирует только по месту своего образования [1, 20, 22].

Активация кислорода возможна также путем передачи ему энергии без переноса электрона, что приводит к образованию синглетного кислорода (¹О₂) — крайне реакционноспособной молекулы. Электронная конфигурация синглетного кислорода подчеркивает его нерадикальную природу [1, 22].

Активация NOX сопровождается проявлением некоторых вторичных эффектов, которые приводят к перераспределению АКМ: экстрацеллюлярно генерируемый супероксид-анион-радикал и образованная перекись водорода перемещаются во внутренний континуум клетки. Так, возбуждение NOX протеинов приводит к трансмембранному переносу электронов, который сопровождается деполяризацией мембраны клетки и снижением внутриклеточного уровня pH. Данные изменения индуцируют возбуждение некоторых трансмембранных каналов, в частности потенциалзависимых протонных каналов (VSOP) и Na⁺/H⁺-обменников (HNE).

Деполяризация мембраны клетки способствует открытию VSOP и перемещению ионов H⁺ через клеточную мембрану. Обменники HNE регулируют уровень внутриклеточного рН, предупреждая закисление цитоплазмы, и контролируют трансэпителиальный транспорт ионов Na⁺, H⁺, Cl^–. Активация NOX протеинов сопровождается возбуждением аквапоринов (AQP) и хлоридного канала ClC3, которые осуществляют трансмембранный транспорт H₂O₂ и O₂^– соответственно из внеклеточного пространства во внутриклеточный континуум (рис. 6) [24].

Заключение

Генерация активных кислородсодержащих метаболитов в легких преимущественно осуществляется специфическими ферментами, представляющими семейство NOX. Ферменты семейства NOX участвуют как в физиологических реакциях, так и в развитии различных патологических процессов в легких, к тому же ткань легкого особо чувствительна к токсическому воздействию АКМ. Поэтому разработка лекарственных средств, которые специфично регулировали бы активность различных представителей семейства NOX, может открыть новые возможности в предупреждении и лечении острых и хронических заболеваний органов дыхания.