Мобильная версия

UkraineNeuroGlobal

Международный неврологический журнал 6 (84) 2016

Вплив імплантації NeuroGelTM в асоціації з ксеногенними стовбуровими клітинами кісткового мозку на відновлення рухової функції задньої кінцівки щура після спінальної травми

Авторы: Цимбалюк В.І.(1), Медведєв В.В.(2), Рибачук О.А.(3, 5), Козявкін В.І.(4), Драгунцова Н.Г.(1)
(1) — ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова НАМН України», м. Київ, Україна
(2) — Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, м. Київ, Україна
(3) — ДУ «Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України», м. Київ, Україна
(4) — Міжнародна клініка відновного лікування, м. Трускавець, Україна
(5) — Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, м. Київ, Україна

Рубрики: Неврология

Разделы: Клинические исследования

Мета — дослідити вплив імплантації NeuroGelTM в асоціації зі стовбуровими клітинами кісткового мозку (СККМ) на відновлення рухової функції задніх кінцівок щура після експериментальної травми спинного мозку. Матеріали та методи. Тварини — білі безпородні щури-самці (5 міс., 250 г); групи: 1-ша — травма спинного мозку (n = 16); 2-га — травма спинного мозку + гомотопічна імплантація фрагмента NeuroGelTM (n = 20); 3-тя — травма спинного мозку + гомотопічна імплантація фрагмента NeuroGelTM, асоційованого з ксеногенними СККМ миші (n = 16). Модель травми — лівобічний перетин половини спинного мозку на рівні Т11; термін спостереження — 28 тиж., оцінка показника функції задньої іпсилатеральної кінцівки (ПФ ЗІК) — за шкалою Basso — Beattie — Bresnahan. Результати. Ксенотрансплантація СККМ у комплексі з NeuroGelTM подовжує в часі, однак зменшує інтенсивність приросту ПФ ЗІК у гострому та ранньому періодах травматичного процесу, пролонгує фазу значимого збільшення ПФ ЗІК до 6-го місяця включно. У групі 1 значуще (р < 0,05) збільшення ПФ ЗІК спостерігали лише протягом 3–4-го тижня, у групі 2 — протягом 1–2-го та 5–6-го тижня експерименту, у групі 3 — протягом 1–2-го, 4–5-го та 8–24-го тижня. Станом на 28-й тиждень ПФ ЗІК у групі 1 становив 1,6 ± 0,5 бала, у групі 2 — 8,4 ± 0,9 бала, у групі 3 — 11,0 ± 1,5 бала за шкалою Basso — Beattie — Bresnahan. Значущу різницю ПФ ЗІК між групами 2 та 1 відмічали протягом 2–28-го тижня (р < 0,001), між групами 3 та 1 — протягом 1–28-го тижня (р ≤ 0,02). Максимальну різницю ПФ ЗІК між групами 3 та 2 на користь першої відмічали на 24-му тижні (р = 0,055). Висновок. Ксенотрансплантація СККМ змінює динаміку відновлення рухової функції паретичної кінцівки за умови імплантації NeuroGelTM, обумовлює тенденцію до потенціювання позитивного впливу матриксу на перебіг спінальної травми.

Цель — изучить влияние имплантации NeuroGelTM в ассоциации со стволовыми клетками костного мозга (СККМ) на восстановление двигательной функции задних конечностей крысы после экспериментальной травмы спинного мозга. Материалы и методы. Животные — белые беспородные крысы-самцы (5 мес., 250 г); группы: 1-я — травма спинного мозга (n = 16); 2-я — травма спинного мозга + гомотопическая имплантация фрагмента NeuroGelTM (n = 20); 3 — травма спинного мозга + гомотопическая имплантация фрагмента NeuroGelTM, ассоциированного с СККМ мыши (n = 16). Модель травмы — левостороннее пересечение половины спинного мозга на уровне Т11; длительность наблюдения — 28 нед., оценка показателя функции задней ипсилатеральной конечности (ПФ ЗИК) — по шкале Basso — Beattie — Bresnahan. Результаты. Ксенотрансплантация СККМ в комплексе с NeuroGelTM удлиняет во времени, но уменьшает интенсивность прироста ПФ ЗИК в остром и раннем периодах травматического процесса, пролонгирует фазу значимого роста двигательной функции до 6-го месяца включительно. В группе 1 достоверное (р < 0,05) увеличение ПФ ЗИК наблюдали лишь в течение 3–4-й недели, в группе 2 — в течение 1–2-й и 5–6-й недель, в группе 3 — в течение 1–2-й, 4–5-й и 8–24-й недель. По состоянию на 28-ю неделю ПФ ЗИК в группе 1 составил 1,6 ± 0,5 балла, в группе 2 — 8,4 ± 0,9 балла, в группе 3 — 11,0 ± 1,5 балла по шкале Basso — Beattie — Bresnahan. Достоверную разницу ПФ ЗИК между группами 2 и 1 отмечали в течение 2–28-й недель (р < 0,001), между группами 3 и 1 — в течение 1–28-й недель (р ≤ 0,02). Максимальную разницу ПФ ЗИК групп 3 и 2 в пользу первой отмечали на 24-й неделе (р = 0,055). Вывод. Ксенотрансплантация СККМ в комплексе с NeuroGelTM в целом изменяет динамику восстановления двигательной функции паретической конечности, обусловливает тенденцию к потенцированию положительного влияния матрикса на течение спинальной травмы.

Objective. To examine NeuroGelTM with bone marrow stem cells (BMSC) implantation on rat’s hind limb motor function recovery after experimental spinal cord injury. Materials and methods. Animals: outbred albino male rats (5.5 months, 250 g); experimental groups: 1st — spinal cord injury only (n = 16); 2nd — spinal cord injury + immediate homotopical transplantation of NeuroGelTM (n = 20); 3rd — spinal cord injury + analogous transplantation of NeuroGelTM in association with adult mouse BMSC (n = 16). Model of injury: left-side spinal cord hemisection at Т11; the ipsilateral hindlimb function indicator (IHL FI) was detected using the Вasso — Вeattie — Вresnahan scale (BBB). Results. Xenotransplantation of the BMSC together with NeuroGelTM extends the period, but reduces the intensity of IHL FI growth in the acute and early period of traumatic process, prolongs a phase of significant IHL FI growth to the 6th month inclusive. In group 1 significant (p < 0.05) increase of IHL FI was observed during 3rd — 4th week only, in group 2 — during 1st — 2nd and 5th — 6th week, in group 3 — during 1st — 2nd, 4th — 5th and 8th — 24th week. At the 28th week in group 1 IHL FI was 1.6 ± 0.5 points, in group 2 — 8.4 ± 0.9 points, in group 3 — 11.0 ± 1.5 points by ВВВ scale. Significant difference in IHL FI between groups 2 and 1 was being registered for 2nd — 28th weeks (р < 0.001), between groups 3 and 1 — during 1st — 28th week (р ≤ 0.02). The maximal difference between groups 2 and 3 in favor of the first one was noted on the 24th week (р = 0.055). Conclusion. BMSC-xenotransplantation in association with NeuroGelTM changes the dynamics of the paretic limb function recovery, it provides a tendency towards intensification of the NeuroGelTM positive impact on the course of the spinal cord injury.

Ключевые слова

травма спинного мозку; відновне лікування; тканинна нейроінженерія; штучний тканинний матрикс; стовбурові клітини кісткового мозку

травма спинного мозга; восстановительное лечение; тканевая нейроинженерия; искусственный тканевый матрикс; стволовые клетки костного мозга

spinal cord injury; recovery treatment; tissue neuroengineering; artificial tissue scaffold; bone marrow stem cells

doi: http://dx.doi.org/10.22141/2224-0713.6.84.2016.83117

Статтю опубліковано на с. 13-19

Вступ

Відновлення функції спинного мозку є стратегічною біомедичною проблемою, вирішення якої пов’язують із вдосконаленням засобів тканинної інженерії [1–4], біонічного протезування [5–7], фізичної реабілітації [8–12], хірургічних методів трансформації периферійної ланки рухової системи та використанням систем хронічної електростимуляції [13]. Трансплантаційні нейроінженерні втручання, що використовують для відновлення функції спинного мозку, з урахуванням історичного контексту можна умовно розділити на кілька поколінь: І — трансплантація в зону ураження спинного мозку цільних фрагментів тканини (тканинна нейротрансплантація, у тому числі — периферичних нервів) [14, 15], ІІ — імплантація аморфних пористих матриксів різного походження [16–20], ІІІ — імплантація аморфних пористих матриксів в асоціації з одним чи кількома клітинними фенотипами [1, 3], ІV — імплантація просторово впорядкованих матриксів [21], у тому числі асоційованих із незрілими клітинами, V — імплантація матриксів четвертого покоління з внутрішніми чи зовнішніми засобами векторизації аксонального росту, наприклад градієнтами атрактантів чи репелентів, ковалентно з’єднаних із матриксом, градієнтами щільності незрілих клітин у середині матриксу, засобами хронічного введення чи продукції атрактантів каудальніше від зони травми (засоби не розроблені; ті, що певною мірою відповідають вказаному принципу — поодинокі [22–25]).

Більшість сучасних робіт спрямовані на пошук засобів відновлення супраспінальних проекцій на мотонейрони, розташовані нижче травми; відновлення самої популяції мотонейронів важливе у випадку локалізації травми на рівні шийного чи поперечного потовщення — зон інервації кінцівок та діафрагми [26–28].

На сьогодні тканинна нейроінженерія перебуває в стані вичерпання потенціалу ІІІ покоління, розробки та апробації IV покоління перелічених нейроінженерних засобів. До переліку найперспективніших видів незрілих клітин, що трансплантують у комплексі з біосумісними матриксами при травмі спинного мозку, відносять мезенхімальні стовбурові клітини (МСК) різного походження [29–31], багатогранний позитивний ефект яких [32] пов’язують із патотропним хомінгом [32], рідкісним in vivo явищем нейрогенного трансдиференціювання [14, 32–34], зі здатністю до злиття з клітинами реципієнтної тканини [35], мікровезикулярним [36, 37], факторним [32] чи контактними [32, 37] впливами. При цьому трансплантація МСК (у зону травми, інтратекально, інтравентрикулярно чи внутрішньовенно) без використання супутніх нейроінженерних засобів покращує функцію задніх кінцівок щура на моделі забиття чи стиснення спинного мозку в середньому на 3,9 бала за шкалою D.M. Basso, M.S. Beattie та J.C. Bresnahan (ВВВ), тобто на 20 % від обсягу функції інтактної задньої кінцівки [32]. Аналіз деяких експериментальних робіт такого виду [38] дозволяє стверджувати, що ефективність трансплантації МСК у вигляді суспензії є доволі дискусійною, для її верифікації використовують тенденційно витончені, чутливіші методи функціонального тестування, оскільки звична шкала ВВВ не дозволяє виявити значущу перевагу.

У даній роботі наведено результати дослідження ефективності втручання ІІІ покоління — імплантації фрагментів аморфного макропористого біосумісного матриксу NeuroGelTM [16–19, 39, 40], асоційованого з ксеногенними стовбуровими клітинами кісткового мозку (СККМ), — сукупності гемопоетичних та стромальних стовбурових клітин.

Матеріали та методи

Дослідження виконано з дотриманням чинних норм біоетики на білих безпородних щурах-самцях (віварії Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України та ДУ «Інститут нейрохірургії імені акад. А.П. Ромоданова НАМН України») віком 5 міс., масою 250 г, утримуваних у стандартних умовах. Сформовано 3 експериментальні групи: контроль — травма спинного мозку (n = 16); «нейрогель» — травма спинного мозку + гомотопічна імплантація фрагмента NeuroGelTM (n = 20); «нейрогель + СККМ» — травма спинного мозку + гомотопічна імплантація фрагмента NeuroGelTM, асоційованого із СККМ миші (n = 16).

Макропористий гідрогель NeuroGelTM (полі[N-(2-гідроксипропіл)-метакриламід]) є комерційним препаратом, синтезований у лабораторії E. Pinet (FISO Technologies Inc., Квебек, Канада) шляхом гетерогенної полімеризації та асоціації, має пори розміром 2–300 нм [17].

СККМ отримували від мишей-самців лінії FVB-Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J (трансгенних за геном зеленого білка флуорисценції) віком 3 міс., масою 40 г, шляхом вимивання зі стегнових кісток середовищем RPMI‑1640 (Sigma, США). Із цією метою в глибоко анестезованої тварини (внутрішньоочеревинне введення суміші розчинів ксилазину (Sedazіn, Bіowet, Польща; 15 мг/кг) та кетаміну (Calypsol, «Гедеон Ріхтер А.О.», Угорщина; 70 мг/кг)) видаляли обидві стегнові кістки шляхом перетину в ділянках колінного та кульшового суглобів, очищали від м’яких тканин, поміщали в 70 % розчин етилового спирту, обидва епіфізарні кінці кожної кістки стинали, під тиском через діафіз за допомогою інсулінового шприца пропускали рідке середовище RPMI‑1640, вимиваючи вміст порожнини кістки. Для підрахунку кількості клітин об’ємну одиницю отриманого змиву змішували з 3% розчином оцтової кислоти в пропорції 1 : 20 і переглядали в камері Горяєва. Отриману суспензію вносили в культуральний флакон із площею поверхні 25 см2 або на чашку Петрі діаметром 60 мм, загальна кількість клітин становила не менше 10 млн. У подальшому клітини висівали по 4 • 105 клітин/см2 та культивували протягом 2 тижнів, змінюючи поживне середовище кожні 2–3 доби, в умовах зволоженого повітря з 5% СО2 при температурі 37 °С. Перший пасаж проводили при 80% конфлуентності моношару, знімаючи клітини за допомогою 0,02% розчину трипсину/версену (Sigma, США), та пересаджували їх у нові флакони зі щільністю 2 • 104 клітин/см2. СККМ на другий пасаж висаджували в 4-лункові планшети по 3 • 104 у кожну лунку та культивували протягом 7 діб. Частку життєздатних клітин у суспензії визначали на лазерному цитофлюориметрі-сортері BD FACSAria (Becton Dickinson, США) за рівнем накопичення в клітині з денатурованою, фрагментованою чи деспіралізованою ДНК флуоресцентного ДНК-зонда 7-аміноактиноміцину. Відсоток життєздатних клітин у культурі становив 94,1 ± 0,6 %.

СККМ культивували за стандартних умов у середовищі, що містило 42,5 % RPMI‑1640 (Sigma, США), 42,5 % DMEM, 15 % FBS, 2 мM L-глутаміну, 1 нг/мл основного фактора росту фібробластів (Sigma, США). Фенотипування клітин за маркерами CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD117 проводили з використанням моноклональних антитіл до мембранних антигенів миші, мічених флуорохромами (Becton Dickinson, США). Клітини культури досліджували на здатність до направленого диференціювання в адипогенному та остеогенному напрямках. Адипогенне диференціювання включало культивування в середовищі DMEM із високим вмістом глюкози (4,5 г/л; Sigma, СШA), 5% конячої сироватки та 10% ембріональної телячої сироватки (Sigma, СШA), 1 мкл дексаметазону (Sigma, СШA), 200 мкл індометацину (Sigma, СШA), 500 мкл ізобутилметилксантину (Sigma, СШA) та 5 мкг/мл інсуліну (Sigma, СШA); середовище змінювали тричі на тиждень; тривалість диференціювання — 14 діб. Середовище для остеогенного диференціювання включало: DMEM із низьким вмістом глюкози (1 г/л; Sigma, СШA), 10 % ембріональної телячої сироватки (Sigma, СШA), 100 нМ дексаметазону (Sigma, СШA), 10 мМ β-гліцерофосфату (Sigma, СШA) та 50 мкг/мл аскорбат‑2-фосфату (Sigma, СШA). Середовище змінювали тричі на тиждень; тривалість диференціювання — 30 діб. За вивченими ознаками отримана культура відповідала мінімальним критеріям культури СККМ.

Через 5 діб культивування у середовище укладали фрагменти NeuroGelTM розміром 16 мм3, культивували протягом 10 діб, до моменту трансплантації. Фрагменти розтинали на рівновеликі частини розміром 2 мм3, одну з яких фіксували для імуногістохімічної верифікації асоційованих клітин у товщі матриксу, інші використовували для трансплантації. За даними імуногістохімічного дослідження, СККМ добре проникають у товщу гелю, колонізують наявні в ньому пори, проявляють ознаки активної життєдіяльності та диференціювання.

Модель спінальної травми — лівобічне пересічення половини спинного мозку на рівні Т11 [41]. Оперативні втручання здійснювали в умовах загального знеболювання (див. вище), після нанесення травми спинного мозку в тварин групи «нейрогель + СККМ» у рану спинного мозку імплантували фрагмент NeuroGelTM, асоційований із СККМ, розміром 2 мм3, у тварин групи «нейрогель» — фрагмент нативного NeuroGelTM аналогічного розміру. У тварин усіх груп вікно доступу в хребтовий канал прикривали фрагментом підшкірної фасції, м’які тканини та шкіру з’єднували крученими поліамідними хірургічними нитками (ум. № 1, ПАТ «Київхімволокно») у два ряди вузлових швів, ділянку рани обробляли 5% спиртовим розчином йоду. У задню шийну ділянку підшкірно вводили розчин біциліну‑5 (ПАТ «Київмедпрепарат»; ~150–200 тис. ОД на 1 тварину), внутрішньоочеревинно — розчин дексаметазону 6 мг/кг (KRKA, Словенія). Після вказаних маніпуляцій тварин протягом 2–4 годин утримували в приміщенні з підвищеною температурою повітря (30 °C), надалі — у клітках по 3–6 особин при середній температурі 21–24 °C.

Показник функції (ПФ) задньої іпсилатеральної щодо зони травми кінцівки (ЗІК) визначали згідно зі шкалою ВВВ [41, 42] протягом перших 2 місяців — наприкінці кожного тижня, у подальшому — наприкінці кожного місяця.

Тривалість спостереження для усіх тварин становила 28 тижнів; виведення тварин з експерименту здійснювали шляхом передозування вказаних вище наркотичних препаратів.

Статистичну обробку даних здійснювали за допомогою програмного пакета Statistica 10.0, для встановлення вірогідності різниці середніх значень ПФ ЗІК між групами використовували U-тест Манна — Уїтні, результати оцінки вірогідності подавали у вигляді значень показника р із звичним їх трактуванням. Вірогідність змін середніх значень ПФ ЗІК у межах групи впродовж експерименту оцінювали за Вілкоксоном.

Результати та їх обговорення

Імплантація NeuroGelTM станом на 28-й тиждень експерименту призводить до формування підгруп у розподілі значень ПФ ЗІК із квазінормальним розподілом у найбільшій із них (рис. 1а, б); імплантація NeuroGelTM у комплексі з СККМ не нормалізує розподіл ПФ ЗІК (рис. 1в).

Для динаміки ПФ ЗІК, середнього по групі контролю (рис. 2), характерна наявність двох фаз: протягом 1-го місяця спостерігали збільшення ПФ ЗІК до 1,7 ± 0,5 бала за ВВВ (приріст вірогідний упродовж 3-го тижня, р < 0,01 порівняно зі значеннями наприкінці 1-го та 2-го тижнів), рівновеликий невірогідний регрес протягом 5–8-го тижня, повторне збільшення протягом 12–16-го тижня (р < 0,05 порівняно зі значенням на 8-му та 16-му тижнях) та стабілізацію. Станом на 28-й тиждень експерименту ПФ ЗІК становив 1,6 ± 0,5 бала за ВВВ, що під час локомоції по горизонтальній поверхні відповідає наявності поширених рухів лише в одному із суглобів ЗІК за наявності слабких рухів у ще одному суглобі ЗІК [41, 42].

Для динаміки ПФ ЗІК, середнього по групі «нейрогель» (рис. 2), теж характерна наявність двох фаз: протягом 1–3-го тижня спостерігали значуще (р ≤ 0,001) збільшення, що до кінця 5-го тижня частково нівелювалося (р > 0,05); протягом 6–12-го тижня спостерігали повторне збільшення (значуще протягом 7–8-го тижня, р < 0,05), яке з 16-го тижня змінювалося стабілізацією. ПФ ЗІК станом на 28-й тиждень становив 8,4 ± 0,9 бала за ВВВ (р < 10–4 порівняно з групою контролю), що під час локомоції по горизонтальній поверхні відповідає наявності крокових синергій ЗІК підошвою вниз (плантарна установка) без підтримування маси тіла [41, 42].

Двофазність є властивою ознакою також і для ПФ ЗІК, середнього по групі «нейрогель + СККМ»: перша фаза триває протягом 1–2-го тижня, друга — протягом 3–28-го тижня. Протягом 2-го тижня спостерігали найінтенсивніший значущий приріст ПФ ЗІК (з 2,5 ± 0,5 до 5,7 ± 1,0 бала за ВВВ, р = 0,001), протягом 4–5-го тижня — менш інтенсивне, проте значуще збільшення (р = 0,014; р = 0,002), протягом 6–7-го тижня — невірогідне збільшення, протягом 8–24-го — поступове значуще збільшення ПФ ЗІК до 11,0 ± 1,5 бала за ВВВ (р < 0,05). Значення ПФ ЗІК станом на 28-й тиждень відповідає руховій активності, при якій тварина при русі по горизонтальній поверхні часто або постійно (> 50 % часу) підтримує масу тіла, наявна плантарна постановка стопи, однак координація крокового ритму передніх і задніх кінцівок відсутня [41, 42].

Значущою особливістю динаміки ПФ ЗІК у групі «нейрогель + СККМ» є лінійний характер збільшення як протягом першої, так і протягом другої фази, швидкість приросту протягом другої фази стала, втричі поступається швидкості приросту, характерній для першої фази.

Значущу різницю ПФ ЗІК між групами «нейрогель» та «контроль» відмічали протягом 2–28-го тижня (р ≤ 4•10–5), між групами «нейрогель + СККМ» та контролю — протягом 1–28-го тижня (р ≤ 0,02). Максимальну фактичну різницю між групами «нейрогель + СККМ» та «нейрогель» на користь першої відмічали на 24-му тижні (р = 0,055).

Для висунення прийнятних припущень щодо механізмів зміни впливу імплантації NeuroGelTM на перебіг спінальної травм за наявності ксеногенних СККМ слід ураховувати, що будь-який клітинний нейротрансплантат, зокрема мезенхімальної генеалогії, є тригером низки імунних реакцій, потенціює і подовжує тканинне запалення в перифокальній зоні [43–45], причому результат таких реакцій щодо реципієнтної тканини спинного мозку неоднозначний. Позитивний ефект СККМ пов’язують з їх здатністю модулювати імунні реакції в зоні травми шляхом продукції низки цитокінів, активувати антиоксидантні системи (глутатіонасоційованих ферментів, каталази та супероксиддисмутази) клітин перифокальної зони, чинити захисний вплив на аксони, потенціювати їх спраутинг та мієлінізацію [46]. З урахуванням того, що NeuroGelTM чинить подібний вплив на перебіг спінальної травми, що включає обмеження травматичної геморагії, запальних реакцій, активацію цитопротекторних систем, зокрема експресію білків теплового шоку [40], потенціювання спраутингу та росту нервових волокон [17, 19], видається обґрунтованим висновок щодо синергії обох нейроінженерних засобів за сумісним їх застосуванням. Для детального вивчення механізмів взаємодії необхідні подальші дослідження із залученням електрофізіологічного, імуногістохімічного та молекулярно-генетичного методів.

Висновки

1. Ксенотрансплантація СККМ у комплексі з NeuroGelTM подовжує в часі, однак зменшує інтенсивність приросту ПФ ЗІК у гострому та ранньому періодах травматичного процесу, пролонгує фазу значимого збільшення рухової функції до 6-го місяця включно.

2. Незважаючи на подовження фази значущого збільшення, станом на 28-й тиждень експерименту ПФ ЗІК групи «нейрогель + СККМ» сягав 11 балів за ВВВ, невірогідно переважаючи показник групи «нейрогель» на 2,6 бала за ВВВ.

3. СККМ загалом змінює динаміку відновлення рухової функції паретичної кінцівки за умови імплантації NeuroGelTM, формує тенденцію до потенціювання позитивного впливу апробованого матриксу на перебіг спінальної травми.

Список литературы

1. Hydrogels and cell based therapies in spinal cord injury regeneration [Text] / R.C. Assunção-Silva et al. // Stem Cells International. — 2015. — Vol. 2015, Article 948040. — P. 1-24.

2. Siebert J.R. Biomaterial approaches to enhancing neurorestoration after spinal cord injury: strategies for overcoming inherent biological obstacles [Text] / J.R. Siebert, A.M. Eade, D.J. Osterhout // BioMed Res. Int. — 2015. — Vol. 2015, Article 752572. — P. 1-20.

3. Tsintou M. Advances in regenerative therapies for spinal cord injury: a biomaterials approach [Text] / M. Tsintou, K. Dalamagkas, A.M. Seifalian // Neural. Regen. Res. — 2015. — Vol. 10, № 5. — P. 726-742.

4. Using extracellular matrix for regenerative medicine in the spinal cord [Text] / Volpato F.Z. et al. // Biomaterials. — 2013. — Vol. 34, № 21. — P. 4945-4955.

5. Gait speed using powered robotic exoskeletons after spinal cord injury: a systematic review and correlational study / D.R. Louie, J.J. Eng, T. Lam, SCIRE Research Team // J. Neuroeng. Rehabil. — 2015. — Vol. 12, Article 82. — P. 1-10.

6. Control of an ambulatory exoskeleton with a brain-machine interface for spinal cord injury gait rehabilitation / E. López-Larraz et al. // Front. Neurosci. — 2016. — Vol. 10, Article 359. — P. 1-15.

7. Miller L.E. Clinical effectiveness and safety of powered exoskeleton-assisted walking in patients with spinal cord injury: systematic review with metaanalysis / L.E. Miller, A.K. Zimmermann, W.G. Herbert // Med. Devices (Auckl). — 2016. — Vol. 9. — P. 455-466.

8. Changes in locomotor muscle activity after treadmill training in subjects with incomplete spinal cord injury [Text] / M.A. Gorassini et al. // J. Neurophysiol. — 2009. — Vol. 101, № 2. — P. 969-979.

9. Nogo-A antibodies and training reduce muscle spasms in spinal cord-injured rats [Text] / R.R. Gonzenbach et. al. // Ann. Neurol. — 2010. — Vol. 68, № 1. — P. 48-57.

10. Fouad K. Rehabilitative training and plasticity following spinal cord injury [Text] / K. Fouad, W. Tetzlaff // Exp. Neurol. — 2012. — Vol. 235. — P. 91-99.

11. Knikou M. Neural control of locomotion and training-induced plasticity after spinal and cerebral lesions [Text] / M. Knikou // Clin. Neurophysiol. — 2010. — Vol. 121, № 10. — P. 1655-1668.

12. Recovery of neuronal and network excitability after spinal cord injury and implications for spasticity [Text] / J.M. D’Amico et al. // Front. Int. Neurosci. — 2014. — Vol. 8, Article 36. — P. 1-24.

13. Цимбалюк В.І. Реконструктивно-відновна хірургія спинного мозку [Текст] / В.І. Цимбалюк, Ю.Я. Ямінський. — К.: Авіцена, 2009. — 248 с.

14. Цымбалюк В.И. Нейрогенные стволовые клетки [Текст] / В.И. Цымбалюк, В.В. Медведев. — К.: Коваль, 2005. — 596 с.

15. Neurorehabilitation with neural transplantation [Text] / M. Döbrössy, et al. // Neurorehabil. Neural. Repair. — 2010. — Vol. 24, № 8. — P. 692-701.

16. Spinal cord reconstruction using NeuroGel implants and functional recovery after chronic injury [Text] / S. Woerly et al. // J. Neurosci. Res. — 2001. — Vol. 66, № 6. — Р. 1187-1197.

17. Reconstruction of the transected cat spinal cord following NeuroGel implantation: axonal tracing, immunohistochemical and ultrastructural studies [Text] / S. Woerly et al. // Int. J. Dev. Neurosci. — 2001. — Vol. 19, № 1. — Р. 63-83.

18. Spinal cord repair with PHPMA hydrogel containing RGD peptides (NeuroGel) [Text] / S. Woerly et al. // Biomaterials. — 2001. — Vol. 22, № 10. — Р. 1095-1111.

19. Цымбалюк В.И. Спинной мозг. Элегия надежды: монография [Текст] / В.И. Цымбалюк, В.В. Медведев. — Винница: Нова Книга, 2010. — 944 с.

20. Kaneko A.A. 3D nanofibrous hydrogel and collagen sponge scaffold promotes locomotor functional recovery, spinal repair, and neuronal regeneration after complete transection of the spinal cord in adult rats [Text] / A. Kaneko, A. Matsushita, Y. Sankai // Biomed Mater. — 2015. — Vol. 10, № 1. — ID: 015008, doi: 10.1088/1748-6041/10/1/015008.

21. Multichannel silk protein/laminin grafts for spinal cord injury repair [Text] / Q. Zhang et al. // J. Biomed. Mater. Res. A. — 2016, Jul. 30 [Epub ahead of print]. — doi: 10.1002/jbm.a.35851.

22. Neurotrophin‑3 gradients established by lentiviral gene delivery promote short-distance axonal bridging beyond cellular grafts in the injured spinal cord [Text] / L. Taylor, L. Jones, M.H. Tuszynski, A. Blesch // J. Neurosci. — 2006. — Vol. 26, № 38. — P. 9713-9721.

23. Vector-induced NT‑3 expression in rats promotes collateral growth of injured corticospinal tract axons far rostral to a spinal cord injury [Text] / N. Weishaupt et al. // Neuroscience. — 2014. — Vol. 272. — P. 65-75.

24. Exogenous neuritin promotes nerve regeneration after acute spinal cord injury in rats [Text] / R. Gao et al. // Hum. Gene Ther. — 2016. — Vol. 27, № 7. — P. 544-554.

25. Sustained release of Neurotrophin‑3 via calcium phosphate-coated sutures promotes axonal regeneration after spinal cord injury [Text] / A. Hanna et al. // J. Neurosci. Res. — 2016. — Vol. 94, № 7. — P. 645-652.

26. Human iPS cell-derived astrocyte transplants preserve respiratory function after spinal cord injury [Text] / K. Li et al. // Exp. Neurol. — 2015. — Vol. 271. — P. 479-492.

27. Respiratory outcomes after mid-cervical transplantation of embryonic medullary cells in rats with cervicalspinal cord injury [Text] / B.J. Dougherty et al. // Exp. Neurol. — 2016. — Vol. 278. — P. 22-26.

28. Functional recovery after cervical spinal cord injury: role of neurotrophin and glutamatergic signaling in phrenic motoneurons [Text] / L.C. Gill, H.M. Gransee, G.C. Sieck, C.B. Mantilla // Respir. Physiol. Neurobiol. — 2016. — Vol. 226. — P. 128-136.

29. Ex-vivo expanded human blood-derived CD133+ cells promote repair of injured spinal cord [Text] / N. Kamei et al. // J. Neurol. Sci. — 2013. — Vol. 328, № 1–2. — P. 41-50.

30. Safety and neurological assessments after autologous transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells in subjects with chronic spinal cord injury [Text] / Mendonça M.V.P. et al. // Stem Cell Res. Ther. — 2014. — Vol. 5, Art. 126. — P. 1-11.

31. Transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells promotes functional recovery in a rat model of traumatic spinal cord injury [Text] / H.-L. Zhou et al. // Neurochem. Res. — 2016, Jun 28 [Epub ahead of print]. — doi: 10.1007/s11064-016-1987-9.

32. Oliveri R.S. Mesenchymal stem cells improve locomotor recovery in traumatic spinal cord injury: Systematic review with meta-analyses of rat models [Text] / R.S. Oliveri, S. Bello, F. Biering-Sørensen // Neurobiol. Dis. — 2014. — Vol. 62. — P. 338-353.

33. Dennie D. Migration of bone marrow progenitor cells in the adult brain of rats and rabbits [Text] / D. Dennie, J. — P. Louboutin, D.S. Strayer // World J. Stem Cells. — 2016. — Vol. 8, № 4. — P. 136-157.

34. Huang B. Fate determination in mesenchymal stem cells: a perspective from histone-modifying enzymes [Text] / B. Huang, G. Li, X.H. Jiang // Stem Cell Res. Ther. — 2015. — Vol. 6, Article 35. — P. 1-9.

35. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation [Text] / N. Noiseux et al. // Mol. Ther. — 2006. — Vol. 14, № 6. — P. 840-850.

36. Xin H. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke [Text] / H. Xin, Y. Li, M. Chopp // Front. Cell. Neurosci. — 2014. — Vol. 8, Article 377. — P. 1-11.

37. Karantalis V. Use of mesenchymal stem cells for therapy of cardiac disease [Text] / V. Karantalis, J.M. Hare // Circ. Res. — 2015. — Vol. 116, № 8. — P. 1413-1430.

38. Bone marrow mesenchymal stromal cells and olfactory ensheathing cells transplantation after spinal cord injury — a morphological and functional comparison in rats [Text] / A. Torres-Espіn, E. Redondo-Castro, J. Hernandez, X. Navarro // Eur. J. Neurosci. — 2014. — Vol. 39. — P. 1704-1717.

39. Prevention of gliotic scar formation by NeuroGel allows partial endogenous repair of transected cat spinal cord [Text] / S. Woerly et al. // J. Neurosci. Res. — 2004. — Vol. 75, № 2. — P. 262-272.

40. Expression of heat shock protein (HSP)-25 and HSP‑32 in the rat spinal cord reconstructed with Neurogel [Text] / S. Woerly et al. // Neurochem. Res. — 2005. — Vol. 30, № 6–7. — P. 721-735.

41. Модель пересічення половини поперечника спинного мозку. І. Технічні, патоморфологічні та клініко-експериментальні особливості [Текст] / В.І. Цимбалюк та ін. // Укр. нейрохірург. журнал. — 2016. — № 2. — С. 18-27.

42. Basso D.M. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats [Text] / D.M. Basso, M.S. Beattie, J.C. Bresnahan // J. Neurotrauma. — 1995. — Vol. 12, № 1. — P. 1-21.

43. Early inflammatory responses following cell grafting in the CNS trigger activation of the subventricular zone: a proposed model of sequential cellular events [Text] / J. Praet et al. // Cell Transplant. — 2015. — Vol. 24, № 8. — P. 1481-1492.

44. Immunosuppression of allogenic mesenchymal stem cells transplantation after spinal cord injury improves graft survival and beneficial outcomes [Text] / A. Torres-Espin, E. Redondo-Castro, J. Hernandez, X. Navarro // J. Neurotrauma. — 2015. — Vol. 32. — P. 367-380.

45. Immune remodelling of stromal cell grafts in the central nervous system: therapeutic inflammation or (harmless) side-effect? [Text] / D. Le Blon et al. // J. Tissue Eng. Regen. Med. — 2016 [Epub ahead of print].

46. Concise review: spinal cord injuries — how could adult mesenchymal and neural crest stem cells take up the challenge? [Text] / V. Neirinckx et al. // Stem Cells. — 2014. — Vol. 32, № 4. — P. 829-843.