Международный эндокринологический журнал Том 13, №8, 2017
Вернуться к номеру
Новые стратегии ранней диагностики, профилактики, лечения эндокринной и инфекционной патологии у женщин репродуктивного возраста
Рубрики: Эндокринология
Разделы: Медицинские форумы
Версия для печати
/83-1.jpg)
(Продолжение. Начало в предыдущем номере журнала)
В предыдущем номере был представлен обзор ряда докладов, звучавших в рамках Международной медицинской конференции «Synevo Day: 10 лет здоровья в цифрах», которая состоялась 6 октября в Киеве и была приурочена к 10-летию работы лаборатории «Синево» в Украине. Предлагаем вашему вниманию продолжение этого обзора.
С докладом «Клинико-лабораторный консилиум — основа эффективной диагностики» выступил доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, директор научно-методического центра МЗ России по молекулярной медицине на базе СПбДМУ им. И.П. Павлова В.Л. Эмануэль (Санкт-Петербург, Россия).
Владимир Леонидович в начале своего выступления подчеркнул важность лабораторной диагностики как объективного критерия доказательной медицины при гарантированном качестве исследований. Качество лабораторной диагностики — это наличие уверенности в том, что правильно и своевременно назначенный тест для нуждающегося в нем пациента выполнен на достаточном аналитическом уровне и сопровождается необходимой информацией для его интерпретации. Кроме качества, важно учитывать характеристики теста, его точность, скорость получения результатов и затраты на его проведение. Выбор теста зависит от цели проведения исследования. Это может быть:
А. Скрининг (например, диагностика фенилкетонурии).
Б. Диагностика (общий анализ мочи).
В. Дифференциальная диагностика (уровень тропонина при остром коронарном синдроме).
Г. Мониторинг анализа эффективности лечения (липидограмма у больного, получающего лечение статинами).
Затем докладчик остановился на такой серьезной медицинской проблеме, как поражение почек. Он отметил, что на сегодняшний день распространенность данной патологии достаточно высока, что подтверждено эпидемиологическим исследованием, проведенным в 7 европейских странах с участием 11 000 пациентов. Среди практически здоровых изменения выявлялись у 16 %, среди амбулаторных пациентов — у 40 %, а среди стационарных больных — у 57 %.
Основной лабораторный показатель для выявления заболеваний почек — определение белка в моче (протеинурия). Это наиболее важный и практически значимый симптом поражения почек и мочевыводящих путей, который может встречаться изолированно либо в сочетании с другими изменениями мочевого осадка в виде эритроцитурии, лейкоцитурии, цилиндрурии, бактериурии.
В моче здоровых людей обнаружено более двухсот белков, имеющих различное происхождение: одни фильтруются из плазмы крови, другие имеют почечное происхождение или секретируются эпителием мочевого тракта. Но основным компонентом плазменных белков, экскретируемых с мочой, является альбумин. Помимо него в моче также можно обнаружить различные тканевые белки, которые способны проходить через клубочек. Наибольший интерес среди них представляют тканевые белки, выявляемые при поражениях поджелудочной железы, сердца, печени и др.
Интерпретация протеинурии определяется ее патофизиологическими механизмами. В норме гломерулярные базальные мембраны нефрона способны пропускать белки, размер которых не превышает 4 нм, а молекулярная масса (ММ) — не более 70 000 Да. Такие белки свободно фильтруются и реабсорбируются в проксимальных канальцах: сывороточный альбумин, миоглобин, преальбумины, лизоцим и др. Кроме молекулярной массы, размера и конфигурации белковой молекулы большую роль в процессе фильтрации играет ее заряд. Так, прохождение альбумина, имеющего при физиологических значениях рН отрицательный заряд, затруднено именно по этой причине.
Протеинурия может быть физиологической и патологической. В свою очередь, патологическая протеинурия — преренальной, ренальной и постренальной.
Ренальная протеинурия обусловлена поражением клубочков и/или канальцев почек и зависит от степени и характера повреждения. Поэтому в зависимости от состава уропротеинов выделяют три типа протеинурии: высокоселективную, при которой в моче обнаруживаются низкомолекулярные фракции, в основном альбумины (пример — нефротический синдром); селективную — выявляют такие же белки, как при высокоселективной, и протеины с молекулярной массой до 150 000 Да. При неселективной протеинурии в моче обнаруживаются белки с ММ 830 000–930 000 Да.
Тубулярный тип протеинурии характеризуется нарушением реабсорбции белков в проксимальных канальцах почек и преимущественной экс–крецией с мочой низкомолекулярных протеинов. Она характерна для всех состояний, сопровождающихся поражением интерстициальной ткани почек: интерстициального нефрита различной этиологии, в том числе действия нефротоксических агентов различного происхождения, включая токсическое действие лекарственных препаратов (салицилаты, аминогликозиды), отторжения трансплантата, инфекции и обструкции мочевых путей, уролитиаза, болезни Вильсона, балканской нефропатии, синдрома Фанкони. В качестве индикатора тубулярной протеинурии чаще всего использовался β2-микроглобулин (ММ 11,8 кДа). Однако экскреция β2-микроглобулина с мочой наблюдается не только при повреждении почечных канальцев при различных заболеваниях почек, но и при онкологической патологии, миеломной болезни, лимфогранулематозе, болезни Крона, гепатитах и т.д.
Постренальная протеинурия обусловлена попаданием воспалительного экссудата, богатого белком, в мочу при заболеваниях мочевыводящих путей (цистит, простатит).
По выраженности протеинурия может колебаться от микропротеинурии до высокой протеинурии (нефротической). В частности, под термином «микроальбуминурия» понимают экскрецию альбумина с мочой в количестве, превышающем физиологическую норму. К ней принято относить те случаи, когда с мочой за 24 часа теряется от 30 до 300 мг альбумина. Микроальбуминурия может быть единственным проявлением поражения почечного клубочка и является ранним признаком развития диабетической нефропатии у больных с сахарным диабетом, поражения почек при артериальной гипертензии, атеросклерозе, сердечной недостаточности, метаболического синдрома, что может быть использовано для раннего обнаружения и мониторинга дисфункции эндотелия и субклинических повреждений почек.
В последнее время модифицировалось патофизиологическое представление о роли протеинурии как фактора прогрессирования патологии почек, что обусловлено токсическим влиянием протеинов на канальцевый аппарат и индукцией воспалительного процесса медиаторами, продукция которых инициируется патологическим характером, «перегрузочной» реабсорбцией большого количества белка канальцевым аппаратом нефрона. Эти пулы внутриклеточного белка экспрессируют синтез лизосомных протеиназ, таких как катепсин B и D, что приводит к аутолизу клеток почек. Вместе с тем тубулярный синтез хемокинов обусловливает перемещение клеток воспаления (моноциты, макрофаги) из крови в почки, а также продукцию внеклеточных субстанций (фибро–нектин, коллаген IV) в мезангиуме, подоцитах и эпителии канальцев, что способствует интерстициальной перестройке (интерстициальному фиброзу).
Лабораторные методы определения протеинурии достаточно многообразны. Для количественной оценки белка в моче наибольшее распространение получили турбидиметрические методы, основанные на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометрический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа). Под воздействием сульфосалициловой кислоты светорассеивающая способность частиц, образующихся из альбумина, в четыре раза превосходит светорассеивание частицами, образующимися в тех же условиях из глобулинов.
Наиболее чувствительными и точными являются фотометрические методы определения общего белка мочи, основанные на специфических цветных реакциях белков, — биуретовая реакция и метод Лоури, а также методы, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с протеинами.
Для дифференциальной диагностики заболеваний почек проводится оценка уровня протеинурии и ее структуры, осуществляемая с помощью пирогаллолового метода. Селективность протеинурии определяют иммунохимическим и/или электрофоретическим методом. При наличии клинических признаков системного заболевания с протеинурией и признаками парапротеинемии необходима их верификиция. Наилучшим вариантом лабораторных исследований с оптимальной диагностической эффективностью в данной ситуации являются электрофорез белков мочи, иммунохимические методы идентификации проте–инов, верификация моноклонального белка методом иммунофиксации и дифференцировкой плазматических клеток методом проточной цитофлюориметрии.
Далее Владимир Леонидович рассказал о лабораторной диагностике эндогенной интоксикации, являющейся полиэтиологическим и полипатогенетическим синдромом, характеризующимся накоп–лением в тканях и биологических жидкостях избытка продуктов нормального или извращенного обмена веществ или клеточного реагирования. При этом даже опытный врач испытывает трудности в оценке интоксикации, что обусловлено отсутствием универсальных критериев оценки степени токсемии при различных патологических состояниях и разно–образием предлагаемых методов их верификации.
Вместе с тем наличие интоксикационного синдрома диктует необходимость контроля систем гомео–стаза: кислородного, кислотно-основного, водного и осмотического, а также оценки саногенетических систем — связывания, транспорта, превращения (детоксикации), элиминации токсинов (функции почек, печени) и маркеров интоксикации.
Одним из важнейших параметров, определяющих перемещение жидкости в водных секторах организма, является осмоляльность. Ее расчет осуществляют по формуле:
Оosm = 1,86 ХPNa + РG+ Рur+8,
где PNa — концентрация натрия (ммоль/л);РG — концентрация глюкозы (ммоль/л); Рur — концентрация мочевины (ммоль/л).
Разница между расчетной и измеренной осмоляльностью называется дискриминантой осмоляльности и отражает уровень остаточных анионов.
В норме осмоляльность равна 298 мосм/л, однако при некоторых клинических ситуациях этот показатель может изменяться. Например, пациент с поликистозом почек: измеренная осмоляльность = 304 мосм/л, дискриминанта осмоляльности = 6 мосм/л. Вывод: гиперосмоляльность, обусловленная гиперазотемией.
Другой пример — пациент с поликистозом почек: измеренная осмоляльность = 334 мосм/л, дискриминанта осмоляльности = 36 мосм/л. Вывод: гиперосмоляльность, обусловленная гиперазотемией и большим накоплением остаточных анионов.
Для диагностики острого повреждения почек, развившегося вследствие гипотонии, гиповолемии, шока, гипоксии, лекарственных нефропатий, в качестве ургентного маркера используется NGAL (липокалин-2).
Затем докладчик рассказал о параметрах эффективности лабораторных технологий, и прежде всего о диагностической информативности и точности проведения лабораторного исследования. В современных условиях точность исследований опирается на данные о биологической вариации. Известно, что даже у здорового человека результаты исследования испытывают колебания, амплитуда и ритм которых отражают его связь с известными физиологическими процессами, называемыми внутрииндивидуальной биологической вариацией. В популяции индивидуальные амплитуды вариации могут не совпадать, отражая различия между здоровыми индивидуумами. Поэтому суммарные пределы вариации аналита для данной популяции — межиндивидуальная вариация — всегда шире пределов внутрииндивидуальной вариации. Эти пределы у большой группы здоровых людей называют референтными. Значения, выходящие за референтные пределы, рассматривают как отклонения, способные сигнализировать о возможном патологическом процессе.
В заключение своего доклада профессор подчеркнул, что в лаборатории должны использоваться только валидизированные процедуры, то есть процедуры с оценкой основных характеристик: правильности, воспроизводимости, линейности и неопределенности измерений (ISO, Женева). Не–определенность — это параметр, характеризующий разброс значений, которые с достаточным основанием могут быть приписаны измеряемой величине. Неопределенность измерения не означает сомнения в достоверности измерения, наоборот, знание неопределенности предполагает увеличение степени достоверности результатов измерения.
На сегодняшний день для интерпретации данных, диагностики, прогнозирования и мониторинга стали все шире применяться так называемые экспертные системы. Диагностические возможности экспертных систем связаны с тем, что их базы могут аккумулировать знания большого числа высококвалифицированных специалистов, накапливать колоссальные объемы информации, превышающие знания одного человека. Эти системы наиболее прогрессивно развиваются в рамках направления, получившего название Data Mining — добыча, или заготовка, данных. Таким образом, произошла замена парадигмы статистической обработки клинико-лабораторных данных парадигмой их системного анализа.
Кандидат медицинских наук, главный врач меж–областного центра медицинской генетики и пренатальной диагностики Н.П. Веропотвелян (г. Кривой Рог) в своем докладе сообщил о современных стратегиях пренатального скрининга хромосомных анеуплоидий.
Докладчик отметил, что хромосомные анеуплоидии (ХА) являются одной из основных причин перинатальной смертности и детской инвалидности. Популяционная частота ХА составляет 6–8 случаев на 1000 новорожденных, а среди всех мертворождений — 6 %.
Пренатальный скрининг (ПС) хромосомной патологии нередко воспринимают только как метод для выявления плодов с синдромом Дауна. Однако такое понимание не совсем верно. С одной стороны, трисомия по 21-й хромосоме является наиболее изу–ченной и наиболее часто встречающейся (1 случай на 700–800 новорожденных) хромосомной патологией. С другой стороны, пренатальный скрининг не сводится исключительно к выявлению синдрома Дауна. Он позволяет определить значительное количество плодов с синдромами Эдвардса (трисомия 18; 1 : 7000), Патау (трисомия 13; 1 : 12 000–29 000), Шерешевского — Тернера (45, Х; 1 : 1500), Клайнфельтера (трисомия 47, XXY; 1 : 1000), триплоидией (69, XXY; 1 : 20000) и другими хромосомными и генными аномалиями. При этом эффективность ПС синдрома Дауна является маркером качества проведения пренатального скрининга в целом.
В 60–70-х годах ХХ века основополагающим в скрининге на наличие ХА у плода был возраст матери. Однако чувствительность такого подхода была невелика и оценивалась в пределах 35 % с ложноположительными результатами в около 15 % случаев. В 80–90-х годах XX века скрининг основывался на биохимических маркерах, определяемых во ІІ триместре, и детальном УЗИ. Чувствительность такого подхода составляла 55–65 % при ложноположительных результатах около 5 % случаев.
С середины 90-х годов проведение скрининга стало осуществляться в первом триместре, при использовании комбинированной оценки возраста матери, толщины воротникового пространства у плода (ТВП), свободной β-фракции хорионического гонадотропина человека (fβ-ХГЧ) и ассоциированного с беременностью протеина А плазмы (РАРР-А). Чувствительность такого теста составляла до 90 %, ложноположительные результаты — 5 %.
При этом важным прогностическим признаком, оказывающим влияние на частоту хромосомных анеуплоидий, внутриутробную смерть плода и грубые врожденные пороки развития, считается расширение воротникового пространства. Так, при ТВП 10–20 мм хромосомные анеуплоидии наблюдаются в 0,2 % случаев, внутриутробная смерть плода — в 1,0, грубые врожденные пороки развития — в 1,5 % случаев. При ТВП 70–80 мм — в 65, 20 и 45 % случаев соответственно.
В крупном популяционном исследовании с участием 108 982 беременных женщин было выявлено, что толщина воротникового пространства ≥ 3,5 мм встречается в 0,8 % случаев. При этом у таких пациенток в 51 % случаев выявлялась трисомия 21, в 27 % — трисомия 18, в 7 % — трисомия 13.
На сегодняшний день известно, что более 50 врожденных пороков развития и генетических синдромов ассоциируются с расширенным воротниковым пространством и нормальным кариотипом плода. Оценку ТВП проводят с помощью УЗИ воротниковой зоны на 11–13-й неделе беременности. Частота детекции трисомии 21 только при дилатации ТВП составляет от 30 до 50 %, при этом доля ложноположительных результатов составляет 5 %. Вместе с тем сообщается, что при наличии синдрома Дауна значения ТВП могут находиться в пределах нормы для данного срока беременности.
Кроме того, необходимо учитывать, что на результаты ультразвукового скрининга могут влиять такие факторы, как технологические возможности сканера (поколение, класс, уровень, технологии и режимы сканирования); ятрогенные факторы — квалификация специалиста; методические (стандартизация и высокая воспроизводимость методики оценки биопараметров), эндогенные — анатомо-морфологические особенности пациентки.
Пренатальный скрининг синдрома Дауна по материнскому возрасту и биохимическим маркерам в I триместре беременности обеспечивает частоту обнаружения данной патологии 65 % при 5 % ложноположительных результатов (Wright et al., 2010). Такой анализ целесообразно проводить с 9-й по 10-ю неделю беременности, так как разница в РАРР-А между трисомией и эуплоидной беременностью больше выражена на более ранних сроках беременности. При врожденных пороках сердца плода наблюдается снижение уровня биохимических маркеров и толщины воротникового пространства как у плодов с нормальным кариотипом, так и у плодов с трисомией 21.
В 2003 году K. Spencer было определено влияние аналитической вариабельности на индивидуальный риск и установлено, что даже небольшое увеличение коэффициента вариации (КВ) — до 4–5 % для биохимических маркеров приводит к росту общего КВ-риска более чем на 15 %. Поэтому, согласно требованиям FMF, коэффициент вариации должен быть менее 3,5 %.
Для расчета индивидуального генетического риска хромосомных анеуплоидий применяются специальные компьютерные программы: Astraia, PRISA, Fastscreen II (Германия) и Life Cycly (Финляндия). При каждом конкретном скрининговом тесте индивидуальный риск хромосомной патологии плода рассчитывается путем умножения базового риска на величину правдоподобия теста.
В настоящее время более 300 центров в мире проводят пренатальный скрининг в I триместре по единому алгоритму, разработанному FMF, и производят вычисление индивидуального риска по единой компьютерной программе First Trimester Screening Soffware.
На X Всемирном конгрессе медицины плода было предложено применение двухэтапного ранжированного скрининга. На первой его стадии оценка риска осуществляется по результатам стандартного комбинированного скрининга I триместра. У пациенток с риском 1 : 50 и более результат анализа считается положительным, а при величине риска менее 1 : 1000 — отрицательным. Беременные с промежуточным риском от 1 : 51 до 1 : 1000 проходят вторую стадию скрининга (с прицельной эхографической оценкой носовой кости, кровотока в венозном протоке и через трикуспидальный клапан или печеночную артерию), по результатам которой модифицируют уровень риска, определенного на первом этапе. Если скорректированный риск составляет 1 : 100 и более, результат скрининга считается положительным, т.е. предполагает последующее проведение инвазивной процедуры. Чувствительность обнаружения ХА в этой модели скрининга составляет 96 % при частоте ложноположительных результатов 3 %. Также было пересмотрено и рекомендовано новое пороговое значение скорректированного риска 1 : 150 как показание к проведению инвазивной ПД.
С 2011 года в качестве дополнительного инструмента массового пренатального скрининга хромосомных анеуплоидий стал применяться метод неинвазивной пренатальной диагностики/теста (NIPD/NIPT) с определением свободной фетальной ДНК плода, присутствующей в крови матери. Для свободно циркулирующей ДНК плода характерна детекция с 4-й недели гестации; стабильность до 2 часов; фракция — 2–20 % свободно циркулирующей ДНК; фрагментация: на 80 % состоит из коротких фрагментов, в среднем до 200 п.н. Источником ее являются клетки трофобласта (апоптозные, некротические) и фетальные клетки (1 на 1 млрд материнских).
Клинически NIPT применяют для RHD-титрования, определения пола плода, моногенных заболеваний, детекции хромосомных анеуплоидий и микроделеционных синдромов.
Определение хромосомных анеуплоидий происходит посредством детекции количества коротких картированных фрагментов, относящихся к той или иной хромосоме. При этом может быть использован метод s-MPS (Shotgun massively parallel sequencing), основанный на секвенировании и подсчете большого количества уникальных (одиночных локусов) фрагментов ДНК в плазме и определении, из какой хромосомы они возникли. Другой метод — t-MPS (Nargeted massively parallel sequencing) включает в себя дополнительный этап, который избирательно усиливает только области хромосом, представляющих интерес (например, хромосомы 21, 18 и 13), а затем оценивает, существует ли избыток для одной конкретной хромосомы по сравнению с другой. Также может применяться метод Analizing SNPs, основанный на анализе SNPs и определении относительного количественного вклада материнской и эмбриональной ДНК в плазму.
Таким образом, полногеномное секвенирование позволяет установить наличие генетических аномалий Т21, 13, 18, других анеуплоидий и микроструктурных аномалий плода и выявить мозаичные анеуплоидии (47, ХХХ; 45Х/46ХХ), рак и микроструктурные аномалии матери. В некоторых случаях при проведении NIPT возможно получение дискордантного результата, что может объясняться низкой фетальной фракцией, фетоплацентарным мозаицизмом плода либо «исчезающими» близнецами; со стороны матери — хромосомной анеуплоидией и малигнизацией.
Далее докладчик остановился на недостатках NIPT, отметив сложности идентификации результатов при многоплодной беременности, сбалансированной структурной перестройке хромосом, дискордантности фетоплацентарного кариотипа, вследствие ограниченного плацентарного мозаицизма, в ситуациях, когда беременная — носитель мозаичной ХА, аналогичной у плода (в том числе регулярной, немозаичной). При NIPT невозможно количественно определить процентную долю аномальных клеточных клонов при хромосомном мозаицизме плода, а также правильно интерпретировать результат при злокачественной онкологии беременной: узловой склерозирующей лимфоме Ходжкина, серозной карциноме яичника, множественной миеломе, миелодиспластическом синдроме.
Однако, несмотря на недостатки и ограничения NIPT, в настоящее время его применение широко распространено во всем мире. Основные компании-разработчики — Ariosa Diagnostics, Illumina, Natera-Sequenom (США) и Berry Genomics, BGL (Китай); модифицированных тест-систем — Verinata Health, Panorama (Канада), Codekx AG (Германия), Genoma (Швейцария). Чувствительность этих тестов составляет более 99 %, при этом ложноположительный результат выявляется лишь в 0,1–0,9 % случаев (0,1 % для Т21 и 0,9 % для трисомии по 13-й хромосоме).
Для количественной оценки генетического материала некоторых хромосом без учета их происхождения проводят массовое параллельное секвенирование методом Shotgun c использованием тестов Sequenom Materni T21, IlluminaVerifi, Berry BAMBINI, BGLNIFTY либо таргетное секвенирование с применением Ariosa Harmony.
Для идентификации и анализа отдельных хромосом плода/плодов назначается таргетное секвенирование + ОПН (SNP) с использованием тестов Natera Panorama®. Такой метод анализа обладает несомненными клиническими преимуществами: Panorama® — единственный NIPТ, который различает ДНК матери и плода, выявляет замирающий 2-й плод, точно определяет пол плода, выявляет триплоидию, измеряет фетальную фракцию, выявляет риски по микроделециям и имеет меньше ложноположительных результатов.
Было проведено огромное количество независимых исследований по Panorama®, подтвердивших его несомненные преимущества. Именно поэтому Panorama® рекомендован Ассоциацией акушеров и гинекологов Америки и Евросоюза, а также Меж–дународным сообществом по пренатальной диагностике (FMF) как первая линия скрининга в 1-м триместре для всех беременных. Его назначают в 70 странах мира, в том числе в нашей стране. В Украине в лаборатории SYNEVO для выявления хромосомных анеуплоидий применяются тесты Natera (США), Panoramatest Tumer для выявления трисомий 21, 18 и 13, моносомии Х, трисомии половых хромосом и 5 микроделеционных синдромов; стоимость такого анализа составляет от 14,2 до 18,2 тыс. грн. В Европе — от 300 до 1500 евро. В связи с этим широкое внедрение NIPT для тестирования на хромосомные анеуплоидии пока остается под вопросом. Так, стоимость выявления дополнительного случая синдрома Дауна при использовании рутинного скрининга (NIPT) — $4 млн. Если же использовать в дополнение к комбинированному скринингу NT, PAPP-A, β-CGH (стоимостью $200) + 2 дополнительных биохимических маркера PIGF, AFP (50$) + NIPT-контингентный скрининг — $2,2 млн на один плод с синдромом –Дауна. Тогда как пожизненное содержание человека с синдромом Дауна — $1 млн (Cuckle H., 2013).
Также следует отметить, что отрицательный тест NIPT не может полностью исключить трисомию, в отчете подается только скорректированный риск. В случае положительного теста необходима верификация хромосомных анеуплоидий с помощью инвазивной пренатальной диагностики, так как ложноположительный результат составляет до 1 %. NIPT не диагностирует 8–11 % других хромосомных аномалий, не предоставляет информацию об остальных осложнениях беременности (например, дефекты плода, преэклампсия, задержка внутриутробного роста плода). Он является слишком дорогостоящим тестом для безвыборочного массового скрининга. Исключая комбинированный тест с УЗД и оценкой ВП, NIPT ухудшает диагностику другой врожденной и наследственной патологии. То есть NIPT следует предлагать только как вторичный скрининг для женщин с повышенным и средним риском хромосомных анеуплоидий, поскольку он не может заменить сегодняшние стратегии скрининга и инвазивную диагностику.
В 2014 г. на XIII Всемирном конгрессе медицины плода (Ницца, Франция) проводилась отдельная секция, посвященная NIPT, в которой участвовало большое количество экспертов со всего мира. В рамках обсуждения были предложены новые стратегии применения NIPT. Самая эффективная модель, согласно рассчитанной экономической и социальной целесообразности, была представлена в виде так называемого контингентного скрининга (Nicolaides R.H., Gill M.M.). Данное понятие заменило предыдущее, подразумевающее проведение биохимического теста во II триместре только у пациенток группы среднего риска после комбинированного скрининга I триместра и решения по результатам второго биохимического теста о необходимости пренатального кариотипирования.
Новая модель контингентного скрининга основана на последовательном применении комбинированного скрининга (с пересмотренной градацией риска по группам) и NIPT, по результатам которого определяется необходимость проведения инвазивной ПД.
По подсчетам K.H. Nicolaides, применение рутинного скрининга (NIPT вместо комбинированного скрининга) позволило бы повысить чувствительность теста до 99 % для трисомии 21, трисомии 18 и до 96 % для трисомии 13 с необходимостью применения инвазивной ПД у 1 % женщин в популяции.
В то же время модель контингентного скрининга при практически аналогичной чувствительности к указанным трисомиям позволяет снизить уровень инвазивных вмешательств до 0,8 %, что существенно в масштабах популяции.
Таким образом:
— NIPT — наиболее чувствительный скрининговый тест на распространенные анеуплоидии;
— NIPT следует проводить беременным со значением среднего индивидуального риска ХА по результатам комбинированного пренатального скрининга в 11–14-ю неделю гестации;
— беременным с высоким индивидуальным риском ХА, не желающим пройти ИПД, может быть выполнен NIPT;
— NIPT не является диагностическим тестом;
— свободный циркулирующий ДНК плода попадает в материнский кровоток из цитотрофобласта, продуцирующего его, поэтому NIPT может достичь чувствительности и специфичности только методом биопсии хориона с прямым или краткосрочным культивированием трофобласта;
— нормальный результат NIPT в сочетании с аномальными УЗ-находками может быть подтвержден методом БВХ;
— аномальный результат NIPT в сочетании с нормальным результатом УЗИ подтверждается только амниоцентезом, поскольку БВХ не исключает ограниченный плацентарный мозаицизм;
— амниоцентез по-прежнему считается золотым стандартом в пренатальной диагностике хромосомных анеуплоидий;
— отрицательный NIPT не исключает наличие у плода другой хромосомной патологии, редких трисомий, структурных аномалий кариотипа, хромосомного мозаицизма, полиплоидии;
— позитивный результат NIPT и нормальный кариотип плода, полученный в результате ИПД (анатомически) по данным УЗИ, предполагает дополнительное прицельное обследование матери на онкопатологии.
С докладом «Мы понимаем, что ищем: преимущества использования NIPT в пренатальном скрининге» выступила международный медицинский директор компании Natera Inc, доктор философии и медицинской этики Samantha Leonard (США).
Samantha Leonard сообщила, что к наиболее часто встречающимся типам генетического полиморфизма относится полиморфизм одиночных нуклеотидов (SNP), или так называемые вариации последовательности ДНК, возникающие при изменении одной пары оснований (нуклеотидов) А, Т, С или G. Это нормальные генетические изменения, которые происходят у каждого человека и отличают одного индивида от другого.
На основании SNP был разработан новый пренатальный неинвазивный тест Panorama®, позволяющий выделить свободно циркулирующую клеточную ДНК плода в крови матери. Panorama® уникально различает ДНК матери и ДНК плода; определяет фракции плода, генотип матери; достоверно определяет пол ребенка; распознает ДНК исчезнувшего близнеца; обнаруживает триплоидию.
Измерение свободно циркулирующей ДНК плода является основным показателем, необходимым для точной интерпретации результатов. В среднем фетальные фракции составляют 10–12 % и могут варьировать в зависимости от гестационного возраста, веса матери, плацентарных факторов и факторов беременности. Низкие фетальные фракции, менее 2,8 %, затрудняют получение достоверного результата.
Panorama® позволяет просчитать риски большего количества значимых хромосомных патологий по сравнению с другими неинвазивными пренатальными методами, а также с высокой точностью определяет большинство распространенных синдромов микроделеции.
В настоящее время рядом эпидемиологических исследований обнаружено, что синдром Ди Джорд–жи (микроделеция 22q11.2) встречается с частотой 1 : 2000–4000 детей. Хотя, по мнению некоторых исследователей, он имеет такое же распространение, как и синдром Дауна. Но в отличие от синдрома Дауна, риск которого повышается с возрастом матери, данная патология не зависит от возраста беременной женщины.
Для синдрома Ди Джорджи характерна задержка умственного и психического развития ребенка в 70–90 % случаев, небные патологии — 70 %, нарушения иммунной системы — 75 %, врожденные пороки сердца — 75 %, гипокальциемия — 77 % и развитие шизофрении в зрелом возрасте — 25 %.
Поэтому в данной ситуации уже на ранних этапах должны быть решены такие вопросы, как рож–дение ребенка в специализированном неонатальном центре, задержка с введением живых вакцин, мониторинг уровня кальция, выявление небной расщелины и небно-глоточной недостаточности.
Определенную озабоченность при этом вызывает риск получения ложноположительных результатов. Но компанией была проделана большая работа по совершенствованию теста, поэтому количество ложноположительных результатов сведено к минимуму: для микроделеции 22q11.2 — 0,31 %, для остальных — 0,06 %.
Далее докладчица сообщила о рекомендациях, разработанных для NIPT различными профессиональными сообществами. Так, Американский колледж медицинской генетики и геномики (ACMG) рекомендует информировать всех беременных женщин о NIPT как о самом чувствительном варианте скрининга среди всех традиционных скринингов анеуплоидий и считает NIPT альтернативным вариантом комбинированного скрининга I триместра беременности.
Генетический совет (2016) поддерживает применение пренатального скрининга свободноклеточной ДНК, известного как NIPT, для всех беременных пациенток. Любая женщина, независимо от степени риска, может выбрать такую стратегию скрининга, как анализ свободноклеточной ДНК для выявления хромосомных анеуплоидий.
Специалисты Королевского общества акушеров-гинекологов Великобритании (RCOG) полагают, что в настоящее время NIPT должен стать первичным звеном скрининга хромосомных аномалий во время беременности.
Затем докладчица рассказала о возможных причинах ложноположительных результатов тестов, и прежде всего о материнском мозаицизме, который может привести к подобным результатам из-за невозможности различить ДНК плода и ДНК матери. В исследовании, проведенном M. Russeil еt al., с участием 187 женщин с ложноположительными результатами было обнаружено, что 8,6 % из них связаны с материнским мозаицизмом.
Причина возникновения материнского мозаицизма может заключаться в следующем: с увеличением возраста женщины некоторые из клеток начинают терять Х-хромосому, поэтому неинвазивные пренатальные тесты могут некорректно фиксировать моносомию по Х-хромосоме, регистрируя недостаточное количество Х-хромосом в материнской плазме крови. В качестве единственного неинвазивного пренатального теста, различающего ДНК матери и ДНК ребенка, может быть предложена Panorama®, которая с высокой точностью определяет хромосомные патологии плода даже при наличии материнского мозаицизма.
Кроме того, ложноотрицательные результаты могут быть получены при низких фетальных фракциях. Установлено, что снижение фетальных фракций происходит при раннем гестационном возрасте, высоком материнском ИМТ, погрешностях при заборе образцов, анеуплоидиях (трисомиях 21, 18 и 13).
Если количество фетальных фракций недостаточно и получить результат не представляется возможным, следует еще раз сделать забор крови и провести повторный тест. В случае очередной не–удачи рекомендовано получить генетическую консультацию, провести ультразвуковое исследование и пройти диагностическое тестирование.
В качестве примера Samantha Leonard представила вниманию слушателей клинический случай: пациентка 35 лет, 1-я беременность, обнаружено расширение воротникового пространства до 6,9 мм, на 11-й неделе беременности сделан комбинированный скрининг I триместра, показавший высокий риск по трисомии 21, 18, 13. Тест NIPT дал отрицательный результат по анеуплоидиям. УЗИ показало патологию плода, а амниоцентез позволил выявить генотип 47, XY, +21.
В данной ситуации при анализе недостоверности теста NIPT были выявлены низкие фетальные фракции — 1,7 %, которые и стали причиной ложноотрицательного результата.
Определенные сложности с получением достоверного результата при проведении NIPT существуют при многоплодной беременности. При двуплодной беременности большое значение имеет зиготность двойни. При монозиготной двойне вследствие генетической идентичности анализ проводится по аналогии с одноплодной беременностью, с определением общей фетальной фракции. Но при этом невозможно определить, какой из плодов имеет генетический дефект. При дизиготной двойне применяемый подход должен основываться на поиске минимальных генетических различий в сравнении с материнским генотипом.
При многоплодных беременностях, возникших как естественным путем, так и посредством искусственного оплодотворения, потеря одного или более эмбрионов происходит в 30 % случаев. Потерянный эмбрион, именуемый также «исчезнувший близнец», оставляет свою ДНК в организме матери, что само по себе может повлиять на интерпретацию генетической информации выжившего эмбриона. В большинстве случаев потеря близнеца является следствием генетических аномалий.
Клинический случай: беременная 35 лет, в анамнезе «исчезающий близнец» на 8-й неделе гестации. Тест Panorama®, проведенный на 10-й неделе, вы–явил риск возможной триплоидии, или «исчезающего близнеца». Другой NIPT на 13-й неделе показал нормальный плод мужского пола; УЗИ на 17-й неделе — женский плод, без патологии. При рождении — нормальная девочка, 46 ХХ.
Таким образом, NIPT на 13-й неделе обнаружил и исследовал ДНК «исчезающего близнеца» мужского пола.
Также тест Panorama® позволяет с высокой вероятностью определить триплоидии — наличие у плода полных трех гаплоидных наборов хромосом (три копии каждой хромосомы). В среднем из 1 тысячи беременностей на сроке 12 недель одна является триплоидной, будучи причиной серьезнейших генетических аномалий плода, повышения риска спонтанного аборта и преэклампсии.
Таким образом, тест Panorama® — это безопасный и высокоточный неинвазивный пренатальный ДНК-тест (NIPT), открывающий новые возможности в диагностике хромосомных заболеваний на раннем сроке беременности (начиная с 9-й недели): трисомии по 21, 18 и 13-й паре хромосом, моносомии по Х-хромосоме, триплоидии и микроделеции, мозаицизма матери, пола ребенка.
Burkhard Manfras, доктор медицинских наук, специалист по внутренним болезням, эндокринологии, диабетологии, андрологии, инфекционным заболеваниям (г. Ульм, Германия), выступил с докладом «Нарушения углеводного обмена у женщин репродуктивного возраста».
В начале выступления докладчик отметил, что во всем мире гестационный диабет (ГД) является одним из самых частых заболеваний, связанных с беременностью. Он повышает риск преждевременных родов, преэклампсии, макросомии и патологии у новорожденных. Кроме того, в 7 раз увеличивает риск манифестации сахарного диабета 2-го типа у матери и у детей с избыточной массой тела на протяжении всей жизни. В последние годы отмечается рост ГД среди беременных женщин. Согласно статистическим данным, в период с 2002 по 2015 год в Германии заболеваемость данной патологией выросла в 3 раза. Все это делает ГД важной междисциплинарной проблемой, с которой встречаются акушеры-гинекологи, терапевты, эндокринологи, неонатологи и педиатры.
Гестационный диабет — это нарушение толе–рантности к глюкозе различной степени выраженности, возникшее или впервые выявленное во время беременности. К основным причинам его развития относятся преходящая инсулинорезистентность либо манифестация диабета 1-го типа во время беременности, а также предшествующий, но не выявленный СД 2-го типа.
В модифицированной классификации P. White гестационный диабет делится на два типа в зависимости от степени гипергликемии и применяемого метода лечения.
Тип А1: ПТТГ (пероральный тест на толерант–ность к глюкозе) превышает норму, тогда как натощак и через 2 часа после приема пищи отмечается ее нормальный уровень. Для контроля уровня глюкозы достаточно модификации диеты.
Тип А2: патологический ПТТГ сочетается с высоким уровнем глюкозы натощак и/или после приема пищи. Эугликемическое состояние достигается назначением инсулина либо другой медикаментозной терапией.
Еще в 1952 году Jorgen Pederson сообщил о том, что вследствие материнской гипергликемии развивается гипергликемия плода. Это приводит (Сousаn, 1995) к неонатальной гипогликемии, желтухе новорожденных, развитию респираторного дистресс-синдрома, дистоции плечиков, гипокальциемии и полицитемии. В долгосрочной перспективе такие последствия проявляются увеличением риска нарушения гомеостаза глюкозы, развития диабета (Petil, 1988) и ожирения (Dabelea H., 2000).
Последствия гестационного сахарного диабета для матери (Сousаn, 1995; Kim et al., 2002) чреваты развитием гипертонии, преэклампсии, инфекций, проведением операции кесарева сечения, повышением риска персистирования диабета после родов. Известно, что риск рецидива гестационного сахарного диабета при последующих беременностях составляет 50 %, причем в течение последующих 10 лет он составляет 30–50 %, последующих 28 лет — 50–70 %.
Считается, что беременность представляет собой физиологический стрессовый тест для β-клеток поджелудочной железы, являясь для организма диабетогенным фактором. Синтез плацентой стероидных гормонов (плацентарного лактогена, эстрогенов, прогестерона), а также повышение образования кортизола в корковом веществе надпочечников при одновременном изменении метаболизма и тканевого эффекта инсулина, ускоренное разрушение инсулина почками и активизация инсулиназы плаценты приводят во время беременности к состоянию физиологической инсулинорезистентности (ИР) с компенсаторной гиперинсулинемией. Последствием ИР и недостаточной секреции инсулина для ее преодоления является повышение концентрации в плазме крови глюкозы, свободных жирных кислот, некоторых аминокислот и кетонов.
Повышение инсулинорезистентности особенно выражено в III триместре беременности, что приводит к снижению действия инсулина на 60 %. С целью компенсации этого состояния в 3 раза усиливается функция β-клеток, увеличивая секрецию инсулина. В свою очередь, гиперинсулинизм сопровождается уменьшением количества инсулиновых рецепторов.
К основным предрасполагающим факторам гестационного диабета относятся возраст, избыточный вес/ожирение, семейная предрасположенность к СД 2-го типа, макросомии плода при предыдущих беременностях, сахарный диабет до беременности, аборты, патологии в предыдущих беременностях, полигидроамнион, синдром поликистозных яичников.
На протяжении многих лет обсуждаются оптимальные стратегии диагностики ГД. II и III Меж–дународные рабочие конференции по ГД и АДА рекомендовали проводить всем беременным скрининговый тест для определения толерантности к глюкозе. Однако универсальное скрининговое тестирование было поддержано не всеми странами. IV Mеждународная конференция по ГД приняла более гибкую стратегию относительно скрининга ГД, заключавшуюся в том, что из тестирования исключаются женщины с риском развития ГД ниже среднего.
В Германии проводят скрининговый тест с 50 г глюкозы всем беременным женщинам на 24–28-й неделе гестации, имеющим высокий риск в первом триместре беременности, либо ПТТГ с 75 г глюкозы. При этом необходимо руководствоваться следующими диагностическими критериями: при случайном обнаружении глюкозы в крови ≥ 200 мг% (11,1 ммоль/л) или при показателях глюкозы натощак ≥ 92 мг% (5,1 ммоль/л) необходимо провести повторный тест измерения глюкозы натощак. Если показатели глюкозы менее 92 мг% (5,1 ммоль/л), то беременная женщина считается здоровой, при глюкозе 92–125 мг% (5,1–7 ммоль/л) предполагается гестационный диабет, при ≥ 126 мг% (7 ммоль/л) – сахарный диабет.
Следует отметить, что в отношении проведения ПТТГ, рекомендации Международных организаций по изучению диабета несколько отличаются друг от друга. WHO, ADA, DDG, HAPO, ACHOIS рекомендуют проведение ПТТГ с разным количеством глюкозы (75–100 г), контролем гликемии в разные временные промежутки (натощак, через 1, 2, 3 ч), различные показатели гликемии и количества соответствия этих показателей (1 или 2) принятым критериям для постановки диагноза гестационного сахарного диабета.
Тест проводят утром натощак, после ночного голодания в течение 10 ч, на фоне обычного питания (не менее 150 г углеводов в день) и обычной физической активности по крайней мере, в течение 3 дней накануне исследования. Перорально принимают 75 г глюкозы, растворенной в 300 мл воды в течение 5 минут. Качество измерения глюкозы конт–ролируется лабораторными методами. В ходе теста определяется гликемия венозной плазмы натощак, через 1 ч и 2 ч. Уровень гликемии натощак ≥ 92 мг% (5,1 ммоль/л), через 1 ч после нагрузки —≥ 180 мг% (10,0 ммоль/л), через 2 ч — ≥153 мг% ( 8,5 ммоль/л) в двух точках свидетельствует о гестационном сахарном диабете в соответствии с критериями Немецкого диабетологического общества.
Определение гликированного гемоглобина HbA1с имеет ограниченное диагностическое значение, что связано с возможной анемией при беременности и более медленным восстановлением гемоглобина. Глюкозурия также не имеет большого диагностического значения, поскольку у большого количества женщин определяется глюкоза в моче.
В исследовании HAPO (Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcomes), проведенном с 2000 по 2006 гг, было установлено, что негативное влияние на течение и исход беременности оказывают даже показатели гликемии, которые несколько выше нормы, но ниже уровня, характерного для СД.
В этом масштабном международном многоцентровом проспективном обсервационном исследовании принимали участие 28 562 беременных из 15 центров. Всем участницам проводили ПТТГ на 24–32-й неделе беременности. В дальнейший анализ включали только женщин, у которых уровни глюкозы крови натощак составляли < 5,8 ммоль/л и через 2 часа после перорального приема глюкозы < 11 ммоль/л, т.е. не соответствовали критериям диабета. Таких пациенток оказалось 23 316. Анализ исходов беременности в этой когорте женщин показал прямую линейную корреляцию между показателями гликемии (натощак, через 1 и 2 ч при проведении ПТТГ) и частотой первичных конечных точек исследования: увеличения массы тела новорожденного, повышения уровня С-пептида в пуповинной крови, первичного кесарева сечения и гипогликемии у новорожденных. Похожая связь была установлена и для вторичных конечных точек: преэклампсии, преждевременных родов, дистоции плечиков, повреждения родовых путей, гипербилирубинемии, необходимости проведения интенсивной терапии новорожденного. Следует подчеркнуть, что корреляция была линейной, т.е. не было какого-либо определенного порогового значения гликемии, после которого риск начинал резко возрастать. Он был повышен даже при очень незначительном увеличении гликемии.
Затем Burkhard Manfras рассказал об основных терапевтических стратегиях при гестационном диабете беременных, направленных на устранение гипергликемии. Необходимо назначение диеты с калорийностью 24/30/40 ккал/кг/24 ч; регулярная физическая активность, повышающая чувствительность периферических тканей к инсулину и улучшающая гликемический контроль. При недостаточном контроле уровня глюкозы, как правило в 1/3 случаев, применяют препараты инсулина. Это единственный из фармакологических методов лечения гестационного СД, убедительно доказавшим свою эффективность и безопасность в отношении течения беременности, а также риска врожденных аномалий плода.
Кроме того, есть основания полагать, что достаточно безопасными для применения во время беременности могут быть пероральные сахароснижающие средства, такие как метформин, глибенкламид. Однако для их широкого внедрения в клиническую практику доказательная база пока недостаточна. В ряде клиник Европы и США метформин уже используется у женщин с гестационным СД, однако к его назначению следует подходить весьма осторожно, поскольку получены данные о незначительном повышении риска малых пороков развития, лактацидоза, мертворождения, гипогликемии у новорожденных. Также нельзя применять во время беременности большинство производных сульфонилмочевины (в связи с высоким риском затяжной гипогликемии у новорожденных) и тиазолидиндионы (обладают тератогенным эффектом).
Важным аспектом у пациенток с гестационным диабетом является проведение консультаций и обучения. Необходимо информировать беременную о значении результатов тестов, оптимальном питании, обучать самостоятельному измерению глюкозы крови, введению инсулина.
Глюкозу крови рекомендуют определять 6 раз в день до и через 1–1,5 часа после еды. Об удовлетворительном контроле углеводного обмена свидетельствует показатели глюкозы натощак от 3,3 до 5,6 ммоль/л, через 1 час после приема пищи – менее 7,8 ммоль/л, через 2 часа после приема пищи – менее 6,7 ммоль/л.
В заключении своего выступления докладчик подчеркнул важность грудного вскармливания как для ребенка, так и для матери. Поскольку именно грудное вскармливание в течение 3 и более месяцев способно уменьшить риск развития диабета у плода с повышенной массой тела, а также риск манифестации СД 2-го типа у матери. После рождения новорожденному необходимо измерение глюкозы крови через 1, 3 и 12 часов. Матери рекомендуется проведение ПТТГ с 75 г глюкозы через 6 недель после родов для реклассификации нарушений углеводного обмена, а затем каждые последующие 2 года.
Подготовила Татьяна Чистик