Мобильная версия

UkraineNeuroGlobal

Международный неврологический журнал Том 16, №3, 2020

Дослідження процесів глікозилювання антитіл у сироватці крові й цереброспінальній рідині хворих на розсіяний склероз як біомаркер при цьому захворюванні

Авторы: Гичка К.М., Негрич Т.І., Білий Р.О.
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, м. Львів, Україна

Рубрики: Неврология

Разделы: Клинические исследования

Метою роботи було вдосконалення діагностики розсіяного склерозу (РС) та визначення нових біомаркерів цього захворювання. Матеріали та методи. Дослідили зміни глікозильних детермінант людини при розсіяному склерозі, які раніше не досліджували. Сконцентрувалися на двох головних напрямках — дослідження глікозилювання антитіл у цереброспінальній рідині (ЦСР), його порівняння з антитілами сироватки крові хворих на РС та визначення природи останніх. Проаналізували клінічний перебіг розсіяного склерозу у пацієнтів з метою виявлення можливих кореляційних зв’язків з імунологічними показниками. Результати. У результаті проведених досліджень отримали дані, що свідчать про зростання експонування фукозильних залишків — мішеней лектину AAL на імуноглобулінах IgG, виділених із ЦСР, а також зростання рівня експонування мішеней лектину LCA (специфічного до корових залишків N-гліканів IgG). Водночас у ЦСР спостерігали значно менший рівень зв’язування сіалоспецифічних лектинів SNA та PSqL, що свідчить про меншу ступінь сіалування молекул імуноглобулінів IgG у ЦСР. Отже, імуноглобуліни IgG у ЦСР мають більш виражені прозапальні властивості порівняно з імуноглобулінами IgG сироватки крові пацієнтів. Висновки. Дослідження процесів глікозилювання антитіл у ЦСР та сироватці крові пацієнтів із РС є надзвичайно важливим як з позиції розгляду їх як ключової ланки в патогенезі цього захворювання, так і як надійного біомаркера вказаного патологічного стану.

Целью работы было совершенствование диагностики рассеянного склероза (РС) и определения новых биомаркеров этого заболевания. Материалы и методы. Исследовали изменения гликозильных детерминант человека при рассеянном склерозе, которые ранее не исследовали. Сконцентрировались на двух главных направлениях — исследование гликозилирования антител в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), его сравнение с антителами сыворотки крови больных РС и определение природы последних. Проанализировали клиническое течение рассеянного склероза у пациентов с целью выявления возможных корреляционных связей с иммунологическими показателями. Результаты. В результате проведенных исследований получили данные, свидетельствующие о росте экспонирования фукозильних остатков — мишеней лектина AAL на иммуноглобулинах IgG, выделенных из ЦСЖ, а также рост уровня экспонирования мишеней лектина LCA (специфического к коревым остаткам N-гликанов IgG). В то же время в ЦСЖ наблюдали значительно меньший уровень связывания сиалоспецифичных лектинов SNA и PSqL, что свидетельствует о меньшей степени сиалирования молекул иммуноглобулинов IgG в ЦСЖ. Итак, иммуноглобулины IgG в ЦСЖ обладают более выраженными провоспалительными свойствами по сравнению с иммуноглобулинами IgG сыворотки крови пациентов. Выводы. Исследование процессов гликозилирования антител в ЦСР и сыворотке крови пациентов с РС является чрезвычайно важным как с точки зрения рассмотрения их как ключевого звена в патогенезе этого заболевания, так и в качестве надежного биомаркера указанного патологического состояния.

Background. The purpose of this work was to improve the diagnosis of multiple sclerosis (MS) and determination of new biomarkers of this disease. Materials and methods. In this work, we are investigating the aspects of changes of human glycosyl determinants in multiple sclerosis that have not been previously investigated. Therefore, we have focused on two main areas — studies of antibody glycosylation in cerebrospinal fluid (CSF) and its comparison with the serum antibodies in patients with MS and determination of their nature. It was important for us to analyze the clinical course of multiple sclerosis in patients to identify possible clinical patterns. Therefore, we carried out a thorough analysis of clinical records of 7 patients; we have taken a serum and cerebrospinal fluid for immunological studies in these patients. The paper presents the results of the analysis. Results. The results of these studies showed an increase of exposure of fucosyl residue — targets of AAL on immunoglobulins G (IgG) isolated from CSF, as well as an increase of exposure level of targets of LCA (specific to cerebral cortex residues of IgG N-glycans). At the same time, we observed a significantly lower binding level of sialospecific lectins SNA and PSqL in the CSF that indicates a lower degree of sialylation of IgG molecules in the CSF. Therefore, immunoglobulins G in CSF have more pronounced pro-inflammatory effects compared to IgG in patients’ blood serum. Conclusions. The study of antibody glycosylation in the CSF and serum of patients with MS is extremely important as a key link in the pathogenesis of the disease and as a reliable biomarker of this pathological condition.

Ключевые слова

розсіяний склероз; біомаркер; глікозилювання; імуноглобуліни; спинномозкова рідина

рассеянный склероз; биомаркер; гликозилирование; иммуноглобулины; спинномозговая жидкость

multiple sclerosis; biomarker; glycosylation; immunoglobulins; cerebrospinal fluid

doi: http://dx.doi.org/10.22141/2224-0713.16.3.2020.203446

Вступ

Розсіяний склероз (РС) — автоімунне захворювання центральної нервової системи (ЦНС), що характеризується пошкодженням мієлінової оболонки та дегенерацією аксонів [1], є найбільш поширеною нетравматичною причиною інвалідності у молодих людей [2–4]. Неухильне прогресування інвалідизації пацієнтів у поєднанні з недосконалим розумінням механізмів виникнення та розвитку РС, складним діагностичним пошуком, лікуванням і прогнозуванням перебігу захворювання доводить необхідність пошуку біомаркерів цього захворювання [5–8]. Завдання біомаркерів полягає в тому, щоб допомогти практикуючому неврологу як у діагностиці самого РС, так і у визначенні його окремих клінічних властивостей, а також у прогнозуванні подальшого розвитку хвороби й оцінці ефективності проведеного лікування [9–11].

Цереброспінальна рідина (ЦСР) є основним діагностичним джерелом, оскільки, омиваючи тканини мозку, вона буде першим середовищем, де можуть накопичуватись «маркери» захворювання, пов’язаного з ЦНС. Оскільки на сьогодні досі не відомі збудники РС, не існує жодного специфічного антитіла, присутність якого вказувала б на наявність РС [12]. З кожним із чотирьох оновлень діагностичних критеріїв РС, що мали місце за останні 20 років [13–16], аналіз ЦСР ставав все менш важливим для підтвердження РС, аж до останніх оновлень у 2010 році, які відзначають важливість аналізу ЦСР.

Зважаючи на концентрацію імуноглобулінів у ЦСР — більшу за очікувану за умов непроникності гематоенцефалічного бар’єра та враховуючи їх концентрацію в сироватці, автори [17] вказають на ймовірне джерело продукції імуноглобулінів у центральній –нервовій системі.

Тому в цій роботі ми вирішили проаналізувати особливості глікозилювання IgG у ЦСР з метою пошуку нових, більш надійних маркерів РС, а також встановлення їх зв’язку із змінами глікозилювання IgG у сироватці крові пацієнтів із РС. З цією метою вивчали парні зразки сироватки крові та цереброспінальної рідини хворих на РС і провели порівняльний аналіз глікозилювання імуноглобулінів.

Матеріали та методи

Робота була виконана на кафедрі неврології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького та у Львівському обласному науковому центрі з вивчення проблем розсіяного склерозу та інших демієлінізуючих захворювань, що знаходиться на базі Львівської обласної клінічної лікарні.

Дослідження ґрунтувалося на положеннях Гельсінської декларації. Комісією з питань біомедичної етики Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (протокол № 5 від 23 лютого 2017 р.) встановлено, що ця наукова робота відповідає етичним та морально-правовим вимогам згідно з наказом Міністерства охорони здоров’я України № 281 від 01.11.2000 р. Від усіх учасників дослідження було отримано письмову інформовану згоду на участь у дослідженні.

Було відібрано та проаналізовано 7 пар зразків сироваток і цереброспінальної рідини хворих на РС та 9 зразків сироватки крові здорових донорів, які були одноразовими донорами крові Львівського обласного центру служби крові. Обстежені пацієнти були віком від 25 до 41 року, тобто всі особи молодого віку згідно з класифікацією Всесвітньої організації охорони здоров’я. Середній вік досліджуваних становив 33,0 ± 5,8 року, серед них були 6 жінок (85,7 %) та 1 чоловік (14,3 %).

У 4 пацієнтів (57,2 %) діагностували клінічно ізольований синдром (КІС), а у 3 (42,8 %) — РС, що відображено на рис. 1.

Тривалість хвороби у цих пацієнтів перебувала в межах від 1 до 13 років, з серединним (медіанним) значенням 1 [1; 1] рік. Бал EDSS знаходився у діапазоні від 1,5 до 2 балів (у всіх пацієнтів був легкий перебіг патологічного процесу), із середнім значенням 1,8 ± 0,3 бала.

В аналізованій групі лише 1 пацієнт (14,3 %) перебував у стадії загострення та приймав пульс-терапію солу-медролом, а інші 6 (85,7 %) не отримували жодного лікування на момент забору лабораторних зразків.

Дослідження олігоклональних антитіл засвідчило, що позитивні результати були у 3 (42,9 %) обстежених, а негативні результати — у 4 пацієнтів (57,1 %).

Після проведення магнітно-резонансної томографії (МРТ) у 4 (57,1 %) пацієнтів спостерігалися зміни, що відповідають критеріям для встановлення вірогідного діагнозу РС, а у 3 пацієнтів (42,9 %) були зміни, що не відповідають МРТ-критеріям для підтвердження вірогідного діагнозу (рис. 2).

Результати та обговорення

Для нас було важливим проаналізувати клінічний перебіг РС у цих пацієнтів з метою виявлення можливих клінічних закономірностей. Тому було детально проаналізовано історії хвороби обраних 7 пацієнтів, в яких провели забір сироватки крові та цереброспінальної рідини для імунологічних досліджень, поданих у роботі. Нижче наведені три типові клінічні випадки. Аналіз цих випадків відображає стан досліджуваної проблеми в цілому.

Пацієнтка 1. Жінка, 26 років, перебувала на стаціонарному лікуванні у неврологічному відділенні КЗ ЛОР «Львівська обласна клінічна лікарня» з 22.10.2018 по 26.10.2018 р.

При огляді — скарги на біль голови стискаючого характеру, періодичне оніміння нижніх кінцівок.

Анамнез захворювання: хворіє протягом двох тижнів.

Неврологічний статус: свідомість збережена, орієнтована у просторі та часі. Зіниці D = S, очні щілини D = S, фотореакції живі, рухи очних яблук в повному обсязі. Поля зору в нормі. Диски зорового нерва (ДЗН) блідо-рожеві, межі чіткі. Обличчя симетричне, ковтання та мовлення не порушені. Язик по середній лінії. Тонус м’язів збережений. Проба Ганева — Нойка негативна. Сухожилкові та періостальні рефлекси пожвавлені D = S. Патологічні рефлекси відсутні. У позі Ромберга похитування, при виконанні сенсибілізованої проби Ромберга похитування. Переконливих розладів глибокої та поверхневої чутливості не виявлено. Координаторні проби виконує задовільно. Під час огляду бал за шкалою EDSS становив 1,5.

На МРТ головного мозку з контрастом: дрібні поодинокі вогнищеві зміни білої речовини головного мозку (рис. 3). МРТ-ознаки не є достатніми для встановлення вірогідного діагнозу РС.

Аналіз ліквору на олігоклональні антитіла: олігоклональні смуги негативні.

Клінічний діагноз «КІС РС у вигляді цефалгічного синдрому, мала ймовірність трансформації у вірогідний РС».

Пацієнтка 2. Жінка, 38 років, перебувала на стаціонарному лікуванні у неврологічному відділенні КЗ ЛОР «Львівська обласна клінічна лікарня» з 02.11.2018 по 19.11.2018 р.

При огляді — скарги на слабкість у правих кінцівках, порушення ходьби, похитування при ходьбі.

Анамнез захворювання: хворіє з 2006 року, відколи почала турбувати слабкість у лівій нозі. Зі слів пацієнтки, періодично лікувалася в КЗ ЛОР «Львівська обласна клінічна лікарня», медична документація відсутня.

Неврологічний статус: свідомість збережена, орієнтована у просторі та часі. Зіниці D = S, очні щілини D = S, фотореакції живі, рухи очних яблук в повному обсязі. Поля зору в нормі. ДЗН блідо-рожеві, межі чіткі. Обличчя симетричне, ковтання не порушене. Дизартрія. Язик по середній лінії. Рефлекси орального автоматизму відсутні. Сухожилкові та періостальні рефлекси D > S високі. Патологічні рефлекси відсутні. Тонус м’язів підвищений в правих кінцівках, м’язова сила знижена в правих кінцівках. Проба Ганева — Нойка негативна. У позі Ромберга похитування, при виконанні сенсибілізованої проби Ромберга похитування. Координаторні проби виконує нечітко. Поверхнева чутливість не порушена, глибока чутливість: при вимірюванні камертоном на руках — 16 с, на ногах — 13 с, знижена вібраційна чутливість. Під час огляду бал за шкалою EDSS становив 2,0.

На МРТ головного мозку з контрастом: множинні вогнищеві зміни білої речовини головного мозку (рис. 4). МРТ-ознаки типові для РС.

Аналіз ліквору на олігоклональні антитіла: олігоклональні смуги позитивні.

Клінічний діагноз «розсіяний склероз, ремітуючо-рецидивуючий тип перебігу».

Пацієнт 3. Чоловік, 35 років, перебував на стаціонарному лікуванні у неврологічному відділенні КЗ ЛОР «Львівська обласна клінічна лікарня» з 02.01.2019 по 03.01.2019 р.

При огляді — скарги на оніміння язика, верхньої та нижньої губи, запаморочення, загальну слабість.

Анамнез захворювання: хворіє протягом двох місяців.

Неврологічний статус: свідомість збережена, орієнтований у просторі та часі. Зіниці D = S, очні щілини D = S, фотореакції живі, рухи очних яблук в повному обсязі. Поля зору в нормі. ДЗН блідо-рожеві, межі чіткі. Обличчя симетричне, ковтання не порушене. Мовлення не порушене. Язик по середній лінії. Тонус м’язів збережений. Проба Ганева — Нойка негативна. Сухожилкові та періостальні рефлекси D = S. Патологічні рефлекси відсутні. У позі Ромберга похитування, при виконанні сенсибілізованої проби Ромберга похитування. Координаторні проби виконує нечітко. Поверхнева чутливість: гіпестезія язика та нижньої третини обличчя. Глибока чутливість: при вимірюванні камертоном на руках — 17 с, на ногах — 15 с, знижена вібраційна чутливість на ногах. Під час огляду бал за шкалою EDSS становив 1,5.

На МРТ головного мозку з контрастом: МРТ-ознаки вогнищевого ураження білої речовини півкуль головного мозку (рис. 5). МРТ-ознаки не є достатніми для встановлення вірогідного діагнозу РС.

Аналіз ліквору на олігоклональні антитіла: олігоклональні смуги позитивні.

Клінічний діагноз «КІС РС у вигляді мозочкового синдрому та чутливих розладів язика і обличчя, висока ймовірність трансформації у вірогідний РС».

Таким чином, на нашу думку, присутність олігоклональних смуг IgG у лікворі є більш чутливим тестом при встановленні діагнозу РС, ніж МРТ, і надійним діагностичним і прогностичним маркером цього захворювання.

На наступному етапі нашої роботи перевірили вміст імунних комплексів, що містили імуноглобуліни IgG та IgM. Вміст імунних комплексів IgG–IgM у зразках ЦСР є значно нижчим у всіх досліджуваних пацієнтів порівняно із таким же вмістом у їх сироватках, також вміст імунних комплексів є нижчим у сироватках здорових донорів (рис. 6).

Як групу порівняння використовували сироватки 9 здорових одноразових донорів крові Львівського обласного центру служби крові відповідного віку та статі.

У дослідженнях цього розділу, окрім порівняння груп пацієнтів аналізом ANOVA, здійснювався додатковий аналіз — парний аналіз досліджуваних груп «сироватка — ЦСР» за допомогою тесту Вілкоксона. Вірогідність зміни парних показників (величина Р) подано як значення вірогідності між порівнюваними парними групами.

Отримані дані свідчать про відсутність імунних комплексів у зразках ЦСР досліджуваних пацієнтів, оскільки отримані значення близькі до рівня інструментальної межі детекції.

Також здійснили аналіз вмісту термінальних залишків сіалових кислот на молекулах імуноглобулінів IgG. Отримані значення оптичної щільності експонування лектинів нормалізувались на оптичні значення детектованого вмісту імуноглобулінів класу IgG.

Аналіз інтенсивності зв’язування молекул лектину SNA (специфічний до термінальних сіалових кислот приєднаних α2,6-зв’язком до галактози) із молекулами імуноглобулінів IgG (нормалізовані значення) наведений на рис. 7. Отримані дані свідчать, що у досліджуваних пацієнтів вірогідно різниться рівень сіалування імуноглобулінів, присутніх у ЦСР та сироватці. Зокрема, у ЦСР рівень сіалування є набагато нижчим, ніж у сироватці тих же пацієнтів (p < 0,001) чи в сироватці здорових донорів (p < 0,0001).

Аналіз зв’язування лектину PSqL (специфічний до термінальних сіалових кислот приєднаних α2,6-зв’язком до галактози в складі біантенних N-гліканів) із молекулами імуноглобулінів IgG наведений на рис. 8. Аналіз зв’язування також показав вірогідно меншу спорідненість імуноглобулінів у ЦСР до лектину PSqL порівняно з імуноглобулінами сироватки пацієнтів із РС в усіх 7 досліджуваних парах зразків, а також продемонстрував зменшення вмісту сіалільних детермінант на імуноглобулінах у ЦСР порівняно із їх вмістом у сироватці здорових донорів та пацієнтів із РС.

Аналіз зв’язування фукозоспецифічного лектину AAL продемонстрував попарне зростання у 6 з 7 досліджуваних пар «ЦСР — сироватка» у зразках ЦСР, при цьому рівень зв’язування лектину SNA із лігандами на імуноглобулінах IgG у зразках ЦСР є вірогідно нижчим за такий у зразках сироваток здорових донорів (рис. 9). Аналіз груп даних у парах виявив вірогідну значущість отриманих значень (p < 0,05). Таким чином, ми спостерігали зростання експонування фукозильних залишків в складі молекул IgG у ЦСР хворих порівняно з їх сироваткою.

Також аналіз зв’язування лектину LCA із фукозильованим триманозним кором N-гліканів показав зростання спорідненості лектину до зазначеної структури імуноглобуліну у зразках сироватки пацієнтів (6 з 7 досліджуваних пар «ЦСР — сироватка») (рис. 10). Спорідненість вказаного лектину може залежати від таких факторів, як поява бісектуючих форм N-гліканів, утворених внаслідок приєднання залишку GlcNAc до корової структури. Бісектуючі глікани відіграють важливу імуномодулюючу роль.

Таким чином, в результаті проведених досліджень ми спостерігали абсолютно відмінні спектри глікозилювання імуноглобулінів у сироватці та цереброспінальній рідині досліджуваних хворих із високим вмістом фукозильованих форм та підвищеним експонуванням частин фукозильованого триманозного кору, зменшенням рівня сіалованих форм гліканів імуноглобулінів у ЦСР.

Висновки

Імуноглобуліни в цереброспінальній рідині хворих на РС містять вірогідно менше мішеней зв’язування лектинів SNA та PSqL-залишків сіалової кислоти приєднаної α2,6-звязком до галактози у складі розгалужених N-гліканів (p < 0,001), вірогідно вищу кількість мішеней лектину AAL-залишків фукози приєднаних до корового залишку N-ацетилгалактозаміну (p < 0,05) та збільшену кількість мішеней зв’язування лектину LCA (p < 0,05) порівняно з сироваткою пацієнтів, хворих на РС.

Беручи до уваги вищеперераховані зміни, можемо вважати, що дослідження процесів глікозилювання антитіл у ЦСР та сироватці крові хворих на РС є надзвичайно важливим як з позиції розгляду їх як ключової ланки в патогенезі захворювання, так і як надійного біомаркера цього патологічного стану.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів та власної фінансової зацікавленості при підготовці даної статті.

Список литературы

1. Мяловицька О.А., Хижняк Ю.В. Прогностична оцінка розвитку когнітивних та емоційних порушень у хворих на розсіяний склероз залежно від локалізації вогнищ демієлінізації в головному мозку. Український неврологічний журнал. 2017. 3. 33-37.

2. Чуприна Г.М. Розсіяний склероз: клініко-патогенетичні характеристики та терапевтичні підходи з урахуванням коморбідності. Східно-європейський неврологічний журнал. 2018. 4. 10-25.

3. Conway D., Cohen J.A. Emerging oral therapies in multiple sclerosis. Current neurology and neuroscience reports. 2010. 10(5). 381-388.

4. Compston A., Coles A. Multiple sclerosis. Lancet. 2002. 359. 1221-1231.

5. D’Ambrosio A., Pontecorvo S., Colasanti T., Zamboni S., Francia A., Margutti P. Peripheral blood biomarkers in multiple sclerosis. Autoimmun. Rev. 2015. 14(12). 1097-1110.

6. Teunissen C.E., Malekzadeh A., Leurs C., Bridel C., Killestein J. Body fluid biomarkers for multiple sclerosis — the long road to clinical application. Nat. Rev. Neurol. 2015. 11(10). 585.

7. Негрич Н.О., Негрич Т.І. Алгоритм використання комплексу лабораторних біомаркерів у хворих на розсіяний склероз з діагностичною та прогностичною метою. Міжнародний неврологічний журнал. 2018. 3. 27-35.

8. Tejera-Alhambra M., Casrouge A., de Andrés C., Seyfferth A., Ramos-Medina R., Alonso B. et al. Plasma biomarkers discriminate clinical forms of multiple sclerosis. PloS One. 2015. 10(6). Е0128952.

9. Chen S., Lu C., Gu H., Mehta A., Li J., Romano P.B., Block T. Aleuria Aurantia Lectin (AAL)-reactive immunoglobulin G rapidly appears in sera of animals following antigen exposure. PloS one. 2012. 7(9). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044422.

10. Compston A., Coles A. Multiple sclerosis. Lancet (Lond., Engl.). 2008. 372. 1502-1517. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(08)61620-7.

11. De Haan N., Reiding K.R., Krištić J., Hipgrave Ederveen A.L., Lauc G., Wuhrer M. The N-glycosylation of mouse immunoglobulin G (IgG)-fragment crystallizable differs between IgG subclasses and strains. Frontiers in immunology. 2017. 8. 608. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00608.

12. Deisenhammer F., Zetterberg H., Fitzner B., Zettl U.K. The cerebrospinal fluid in multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 2019. 10. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00726.

13. McDonald W.I., Compston A., Edan G., Goodkin D., Hartung H.-P., Lublin F.D., Wolinsky J.S. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: Guidelines from the international panel on the diagnosis of multiple sclerosis. Annals of Neurology. 2001. 50(1). 121-127. https://doi.org/10.1002/ana.1032.

14. Polman C.H., Reingold S.C., Banwell B., Clanet M., Cohen J.A., Filippi M., Wolinsky J.S. Diagnostic criteria for multiple sclerosis: 2010 Revisions to the McDonald criteria. Annals of Neurology. 2011. 69(2). 292-302. https://doi.org/10.1002/ana.2236.

15. Thompson A.J., Banwell B.L., Barkhof F., Carroll W.M., Coetzee T., Comi G., Cohen J.A. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. The Lancet Neuro-logy. 2018. 17(2). 162-173. https://doi.org/10.1016/S1474-4422(17)30470-2.

16. Tumani H., Deisenhammer F., Giovannoni G., Gold R., Hartung H.-P., Hemmer B., Zettl U.K. Revised McDonald criteria: The persisting importance of cerebrospinal fluid analysis. Annals of Neuro-logy. 2011. 70(3). 520-520. https://doi.org/10.1002/ana.22508.

17. Keir G., Thompson E.J. Immunoglobulins in CSF. In Immunoglobulins in Health and Disease. 1986. 173-187. https://doi.org/10.1007/978-94-009-4169-4_10.