Международный неврологический журнал 4(20) 2008

Сьогодні поширеність серцево-судинних та судинно-мозкових захворювань зростає в усьому світі. Збільшується фармакологічний потенціал за рахунок новітніх антигіпертензивних та ангіопротекторних препаратів, але, незважаючи на це, кількість дисциркуляторних порушень головного мозку суттєво не знижується. Серед факторів ризику виникнення артеріальної гіпертензії (АГ) (гіподинамія, порушення водно-сольового обміну, гіперхолестеринемія тощо) спадковість уже понад сто років посідає важливе місце. Сьогодні серед найбільш вагомих генів-кандидатів, що беруть участь у розвитку артеріальної гіпертензії, розглядаються гени, що кодують білки — компоненти ренін-ангіотензинової системи (ангіотензинперетворюючого ферменту, рецепторів ангіотензину ІІ 1-го типу та інші) [6, 8, 10]. Останнім часом зростає кількість досліджень, у яких відводиться значна роль поліморфізму рецептора ангіотензину ІІ 1-го типу (АТ1Р) у виникненні артеріальної гіпертензії та визначенні її перебігу (вік виникнення, характер уражень органів-мішеней) [7].

Наразі в Україні, зокрема в популяції мешканців Полтавської та Вінницької областей, продемонстровано зв’язок розвитку артеріальної гіпертензії з поліморфізмом А1166С гена АТ1Р [3]. Визначені особливості перебігу артеріальної гіпертензії (частота уражень органів-мішеней, чутливість до окремих антигіпертензивних препаратів тощо) [1, 2]. Отримані попередні результати, що обгрунтовують необхідність вивчення особливостей перебігу судинних захворювань головного мозку залежно від генетичних факторів, зокрема поліморфізму гена АТ1Р.

Таке припущення підтверджене зростаючою кількістю зарубіжних публікацій щодо ролі поліморфізму АТ1Р у розвитку дисциркуляторної енцефалопатії (ДЕ) та мозкових інсультів [5, 11–13].

Метою нашого дослідження стало вивчення особливостей перебігу гіпертонічної дисциркуляторної енцефалопатії (ГДЕ) залежно від поліморфізму А1166С гена АТ1Р у популяції мешканців Полтавського та Диканського районів Полтавської області.

Матеріали та методи

При проведенні епідеміологічного обстеження в населення Полтавського та Диканського районів Полтавської області нами була виділена група з 112 пацієнтів з артеріальною гіпертензією та дисциркуляторною енцефалопатією. Епідеміологічне дослідження проводили разом зі співробітниками відділу епідеміології ННЦ «Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска» АМН України, м. Київ (професор І.П. Смирнова). Під час дослідження було проведене анкетування хворих, визначення артеріального тиску, росту, ваги, об’єму талії, проведена електрокардіографія, визначені показники вмісту загального холестерину, альфа-холестерину, тригліцеридів за загальновідомими методиками.

ДНК із венозної крові виділяли фенол-хлороформним методом із наступним осадженням етанолом. Для визначення алелей поліморфної ділянки (А1166С) гена судинного рецептора (тип 1) ангіотензину II проводили виділення геномної ДНК із венозної крові обстежуваних методом фенол-хлороформної екстракції [9].

У людей забір крові проводили натщесерце за допомогою одноразових пластикових шприців із кубітальної вени в силіконовані пробірки для центрифугування з розчином гепарину (25 ОД на 1 мл крові). Суспензію лейкоцитів отримували шляхом інкубації при 37 °С протягом 1 години з додаванням 1,8% розчину декстрану (Fluka) у співвідношенні 2 : 1 з наступною дворазовою відмивкою фізіологічним розчином.

Клітини лізували буфером, що містить 10 мM трис-HCl (pН 8,0), 10 мM EDTA, 0,5% додецилсульфата натрію. ДНК екстрагували сумішшю хлороформ-фенолу після обробки їх проназою і преципітували крижаним етанолом у кінцевій концентрації 70 %. Зразки ДНК розчиняли в 10 мM трис-HCl-буфері (pН 8,0), що містить 1 мM EDTA.

Поліморфну ділянку гена AT2R1 ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в 25 мкл реакційної суміші, що містила:

— 2,5 мкл 10 × Buf для ампліфікації;

— 2 мМ хлориду магнію;

— 0,2 мМ кожного dNTP;

— по 66 нг праймерів для AT2R1: AT1R-L (5-CCTGCACCATGTTTTGAGGTTGAGTGAC-3), AT1R-R (5-AAAATAACAGGACAAAAGCAGGCTAGGGAG-3);

— 2,5 од. ДНК-полімерази Tag;

— 20–50 нг геномної ДНК.

У пробірки нашаровували 25 мкл мінерального масла.

Ампліфікацію поліморфної ділянки гена AT2R1 проводили на ампліфікаторі «Терцик» («ДНК-Технология», Москва) у такий спосіб:

— перший цикл — 94 °С/3 хвилини;

— 35 циклів — 94 °С/1 хвилину;

— 65 °С/1 хвилину;

— 72 °С/2 хвилини;

— останній цикл — 72 °С/6 хвилин;

Для ідентифікації алелей до 15 мкл ампліфікаційної суміші додавали 2 мкл 10-кратного буфера G (ТОО «Сибэнзим», Новосибирск), що містить:

— 10 мМ трис-HCl із pH 7,5;

— 10 мМ хлориду магнію;

— 2 мкл БСА (1 мг/мл);

— 1 мкл рестриктази BstDEI (2 од./мкл).

Проби витримували протягом ночі при 65 °С [4].

Продукти розщеплення поліморфної ділянки гена AT2R1 виявляли за допомогою електрофорезу у 6% поліакриламідному або в 2,5% агарозному гелях в 1 × ТВЕ (50 мМ трис-H₃BO₃ та 2 мМ ЕДТА, pH 8,0) (протягом 5 годин при напрузі 2 V на 1 см гелю). Як маркер молекулярної ваги ДНК використовували ДНК лямбда-фага, що розрізана рестриктазою pst1. Гелі фарбували етидіумом бромідом з наступною візуалізацією результатів в УФ-світлі.

Отримані цифрові значення обробляли параметричними та непараметричними методами.

Результати та їх обговорення

Всього під час епідеміологічного обстеження було оглянуто 858 осіб, із яких 409 страждали від артеріальної гіпертензії, що склало 47,6 %, і 320, які хворіли на ДЕ різного ступеня тяжкості (37,3 %). Серед пацієнтів, які страждали від ДЕ, превалювали хворі із 2-м ступенем тяжкості.

Для подальшого аналізу нами були відібрані 112 пацієнтів-чоловіків, які страждали від дисциркуляторної енцефалопатії на фоні артеріальної гіпертензії, усі вони були розподілені за генотипами відповідно до поліморфізму гена АТ1Р на групи СС, АС та АА.

Як видно з даних табл. 1, у групі пацієнтів із генотипом СС спостерігали вірогідно нижчий рівень ДАТ — 95,31 ± 2,03 мм рт.ст., ніж у групі з генотипом АА. Крім того, група СС характеризувалась вірогідно більш раннім розвитком АГ (у середньому 36,50 року) та більшою тривалістю (у середньому 11,38 року), ніж група з генотипом АА (41,96 та 7,25 року відповідно). Як видно при статистичній обробці даних досліджень, спостерігаються вірогідні відмінності між показниками в групах СС та АА, вірогідних відмінностей між показниками в групах СС та АС не спостерігали. Пацієнти з генотипом АС мали переважно проміжні значення. Це свідчить саме про важливе етіологічне значення наявності алеля С.

Наступним кроком стало виявлення особливостей АГ в групах відібраних хворих (табл. 2). Як видно з даних табл. 2, у групі пацієнтів із генотипом СС вірогідно частіше спостерігається систолічний тип АГ (26,92 %) порівняно з генотипами АС та АА (6,45 та 4,17 % відповідно). Змішаний тип АГ спостерігається у 65,38 % пацієнтів, що майже на 30 % менше, ніж у групах АС та АА (90,32 та 95,83 % відповідно). Ізольований діастолічний тип АГ спостерігався рідко, тому важко визначити реальний зв’язок із генотипом. Отже, наявність алеля С в гомозиготному варианті (СС) визначає розвиток систолічного типу АГ.

Відомо, що порушення ліпідного обміну виступають факторами ризику розвитку АГ та наступного ураження органів-мішеней, тому були визначені основні показники ліпідного обміну в пацієнтів із гіпертонічною дисциркуляторною енцефалопатією відповідно до генотипів АТ1Р (табл. 3).

Як видно з даних табл. 3, пацієнти з генотипом СС характеризувалися найменшими змінами показників ліпідного обміну, рівень загального холестерину в цій групі був вірогідно найнижчим. Інші показники — індекс маси тіла, уміст ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ), коефіцієнт атерогенності (КА) ліпідів — були найнижчими порівняно з групами, у яких був присутній алель А (АА та АС). Відповідно в групі з гомозиготним варіантом (АА) зміни ліпідного обміну були найбільш вираженими (вірогідне підвищення рівнів загального холестерину, тригліцеридів, помірні або найвищі значення індексу маси тіла, ЛПНЩ та КА). Ці дані свідчать про те, що алель С, імовірно, відповідає за гемодінамічні порушення, викликані зміною тонусу судин, можливо, за рахунок більшої чутливості рецепторів до ангіотензину ІІ. У той же час в осіб із присутністю алеля А (переважно в гомозиготному варіанті) спостерігали порушення метаболізму ліпідів.

Для об’єктивізації характеристики груп за факторами ризику була оцінена поширеність факторів ризику відповідно до генотипів пацієнтів (табл. 4).

Як видно з табл. 4, не знайдено вірогідних відмінностей між наявністю діабету, палінням, наявністю попередньої антигіпертензивної терапії між пацієнтами з різними генотипами АТ1Р. Як і слід було чекати, виявлені зміни в успадкуванні схильності до артеріальної гіпертензії. Спадковість за артеріальною гіпертензією найчастіше зустрічається в пацієнтів із алелем С, відповідно, найчастіше у випадку АГ у обох батьків, кожен із яких передає алель С, і у нащадків спостерігається генотип СС.

Подібно до даних табл. 4, але більш виражено з генотипами пов’язані прояви порушень ліпідного обміну. Так, наявність гіперхолестеринемії та гіпертригліцеридемії вірогідно пов’язана з наявністю алеля А, особливо в гомозиготному варіанті. Ці дані підтверджують попереднє припущення, що розвиток артеріальної гіпертензії та ураження органів-мішеней у пацієнтів з різними поліморфними вариантами гена АТ1Р відрізняються. Наявність алеля С пов’язана переважно з порушенням регуляції судинного тонусу, а присутність алеля А характеризує переважні порушення ліпідного обміну.

Як видно з табл. 5, наявність інсульту в анамнезі пов’язана з наявністю алеля С, крім того, цей алель відображає наявність спадкового анамнезу за інсультом як в одного з батьків, так і у двох батьків (більшою мірою).

Основним питанням для нас стало виявлення зв’язку між вираженістю неврологічної симптоматики у хворих на гіпертонічну дисциркуляторну енцефалопатію та генотипом АТ1Р. Як видно з табл. 6, ГДЕ І ступеня була переважно виявлена у хворих із генотипом АА та АС, тобто за наявності алеля А. У той же час ГДЕ ІІІ ступеня зустрічалась переважно у хворих із генотипом СС. Звертала на себе увагу відсутність головного болю у хворих з генотипом СС, що є несприятливим фактором внаслідок «маскування» симптомів у хворих з цим генотипом. Пацієнти з генотипом АА та АС відчували виражене запаморочення, з меншим відчуттям хиткості.

Пацієнти з генотипом СС в неврологічному статусі мали більш виражені пірамідні та субкортикальні знаки, мозочкові порушення, у тому числі наявність вираженого ністагму, хиткість у позі Ромберга, грубі порушення координаторних проб (табл. 6).

Висновки

Отже, отримані нами результати демонструють суттєву роль поліморфного алеля С в положенні 1166 гена АТ1Р, яка полягає у визначенні раннього віку виникнення артеріальної гіпертензії, переважно за систолічним типом. Порушення ліпідного обміну переважно визначаються наявністю алеля А, що підкреслює участь алеля С переважно в регуляції судинного тонусу (гіпертензія). Визначається чітка спадковість уражень головного мозку у хворих із генотипом СС і носіїв алеля С, що сягає найбільшої вірогідності при cпадковості за двома батьками (що є зрозумілим з огляду на характер успадкування).

Наявність алеля С (переважно в гомозиготній формі) визначає тяжкість гіпертонічної дисциркуляторної енцефалопатії, що розвинулась. Пацієнти з генотипом СС мали більш виражені пірамідні, субкортикальні та координаторні порушення. Отримані нами дані є підставою для визначення у пацієнтів наявності поліморфних варіантів А1166С гена АТ1Р з метою прогнозування розвитку артеріальної гіпертензії та дисциркуляторної енцефалопатії, формування групи ризику для профілактики виникнення ускладнень.