Журнал «Здоровье ребенка» 4(13) 2008

Пильна увага до проблеми нормальної мікрофлори кишечника, що спостерігається в останні роки, на новому науковому рівні підтверджує значиму роль мікробних екосистем у формуванні здоров'я як дітей, так і дорослих. Фактично кишкова мікрофлора має настільки високу ферментативну активність, що може розглядатися як свого роду друга печінка організму людини.

На жаль, в останні роки кількість дітей із мікроекологічними порушеннями основних біотопів суттєво зростає [1, 10].

Незважаючи на те що дисбіози не входять до переліку основних нозологічних форм і тому, на думку деяких клініцистів, не можуть верифікуватися як клінічний діагноз, в останні роки все частіше мікроекологічні порушення зараховують до ендогенних інфекційно-алергічних станів, що розвиваються в результаті тривалого патогенного впливу мікроорганізмів і, як правило, супроводжуються сенсибілізацією організму з розвитком алергічних реакцій, які є наслідком пригнічення імунобіологічної реактивності [9].

Регулювання імунної відповіді в імунній системі слизових шлунково-кишкового тракту (ШКТ) є одним з актуальних питань сучасної науки, тому що вважається доведеним, що 60–70 % усіх імунних клітин організму функціонують у шлунково-кишковому тракті [2].

На сьогодні відомо, що імунна система слизових ШКТ є частиною загальної імунної системи організму і в той же час еволюційно має ряд особливостей структурного й функціонального характеру, що дозволяють їй уникнути небажаної та потенційно небезпечної реактивності на харчові компоненти та нормальну мікрофлору (пероральна толерантність) і одночасно зберегти швидке реагування на епізодичні загрози патогенів [4].

Тому актуальними є дослідження, спрямовані на встановлення взаємозв'язку між порушеннями мікробіоценозу кишечника, імунного, цитокінового статусу та слизового бар'єру. Визначення особливостей їх формування на ранніх етапах онтогенезу може стати важливим діагностичним та прогностичним фактором розвитку не тільки захворювань органів травлення, а й інших систем організму та дозволить розробити систему лікувально-профілактичних заходів із упередження або зниження бактеріальної та харчової сенсибілізації, нормалізації імунних адаптаційних механізмів.

Цитокіни як невід'ємні складові імунних реакцій, експресія яких розпочинається в результаті антигенного подразнення або пошкодження тканин, можуть стати найбільш чутливими показниками патогенетичних процесів, що розвиваються в результаті реакції на збільшення концентрації бактеріальних та харчових алергенів, зриву імунологічної толерантності або у випадках генетичної детермінованості.

Метою дослідження було вивчення активності сироваткових цитокінів для визначення їх патогенетичної ролі та ефективності функціонування окремих факторів імунної системи в дітей залежно від ступеня зниження колонізаційної резистентності організму при персистенції збільшеного числа потенційно-патогенних бактерій (ППБ) або активації їх вірулентних властивостей.

Матеріали та методи

Обстежені 141 дитина віком від 1 до 6 місяців, із них 91 дитина вигодовувались грудним молоком, а 50 — адаптованими або частково адаптованими молочними сумішами без додавання пре- або пробіотичних компонентів. Під час забору матеріалу всі діти не мали гострих інфекційних захворювань, не отримували антибактеріальну, пре- або пробіотичну терапію.

Мікробіологічну діагностику проводили за методами та вимогами Наказу № 535 МОЗ СРСР від 22.04.1985 р. та Наказу № 59 МОЗ України від 2003 р. За допомогою бактеріологічних методів аналізували кількісний та видовий склад мікрофлори кишечника у дітей першого півріччя життя.

Ступінь порушень біоценозу кишечника оцінювали за методичними рекомендаціями «Діагностика і лікування дисбактеріозів кишечника» (Москва, 1991).

Відповідно до уніфікованої робочої класифікації дисбактеріозів (І.Б. Кураєва, К.С. Ладодо, 1991) виділяли 4 ступеня дисбіотичних розладів кишечника.

Імунологічний статус дітей оцінювали на підставі визначення концентрацій інтерлейкінів у сироватці крові методом імуноферментного аналізу Enzyme-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA) за рекомендованими протоколами до тест-систем Biosource (Netherlands).

Відповідно до поставлених задач діти були поділені на три групи:

— 1-ша (контрольна) група: 47 практично здорових дітей виключно на грудному вигодовуванні без бактеріологічних ознак дисбіозу кишечника;

— 2-га група: 45 дітей, при бактеріологічному обстеженні яких встановлено дисбіоз кишечника I–II ст., із них 28 дітей на грудному та 17 — на штучному вигодовуванні;

— 3-тя група: 49 дітей з дисбіозом кишечника III–IV ст., 16 дітей на грудному вигодовуванні та 33 — на штучному.

Результати дослідження

Визначення концентрацій цитокінів у дітей із дисбіозом кишечника (2-га та 3-тя групи) залежно від характеру вигодовування не виявило вірогідної залежності між рівнем цитокінів у дітей на грудному та штучному вигодовуванні (Р > 0,05), тому надалі вирішено об'єднати дітей у групи залежно від ступеня дисбіозу.

Результати наведених у табл. 1 даних свідчать, що у 68,8 % дітей 2-ї та 59,2 % 3-ї груп відзначається підвищення концентрації прозапального цитокіну IL‑6 порівняно з контрольною групою дітей (Р < 0,005). Встановлено високий діагностичний рівень IL-6 у межах 0,35–0,98 пг/мл та 0,96–2,76 пг/мл відповідно, що дозволило припустити залежність їх концентрації від ступеня бактеріальної агресії.

Концентрація sIL-6R мала зворотну залежність: найбільш високі значення в дітей 1-ї групи — 73,72 ± ± 1,62 нг/мл та зниження по мірі зростання ступеня дисбіозу — 31,93 ± 1,01 нг/мл в 3-й групі.

Зменшення кількості рецепторного компоненту обумовлювало зниження результативної активності IL‑6, про що свідчили показники співвідношення IL-6/sIL-6R, що підвищувались пропорційно ступеню тяжкості дисбіозу (Р < 0,005).

Підвищення концентрації IL-6, як правило, супроводжувалось підвищенням температури тіла у цих дітей, гарячкою, сонливістю, зниженням апетиту. За даними літератури, подібна клінічна симптоматика обумовлювалась стимуляцією клітин печінки до продукування білків гострої фази (CRP, амілоїду А, α2-макроглобуліну і фібриногену), активації системи фагоцитозу, диференціювання В-лімфоцитів та продукції антитіл [1, 2].

Становило інтерес вивчення особливостей продукування найбільш активних прозапальних цитокінів IL-1β, хемокінів (IL-8) та TNF. Отримані дані наведені в табл. 2.

Концентрація IL-1β у дітей із дисбіозом кишечника вірогідно підвищувалась стосовно дітей 1-ї групи (14,04 ± 0,38 пг/мл), але суттєвої різниці в синтезі цього цитокіну в дітей 2-ї та 3-ї груп не спостерігалось (Р > 0,05).

Відомо, що при підвищенні концентрації в крові IL-1β впливає на клітини гіпоталамуса та викликає проліферацію Т-клітин або бере участь в їх індукції [6]. У дітей раннього віку в умовах персистенції маловірулентних збудників подібні реакції активного запального процесу не відбуваються або їх вираження неінтенсивне. З огляду на те, що IL-1β може системно діяти синергічно з TNF і IL-6, отримані дані свідчать про включення у цих дітей саме таких механізмів затяжного запалення з переключенням на синтез В-лімфоцитів.

Відносно IL-8, що викликає спрямовану міграцію (хемотаксис) лейкоцитів в епіцентр запалення, залежність підвищення концентрації від ступеня дисбіозу встановлена найбільш вірогідно. Так, у 86,6 % дітей 2-ї групи концентрація IL-8 коливалась у межах 6,47–12,05 пг/мл, а у всіх дітей 3-ї групи — 19,42–27,03 пг/мл (Р < 0,05). Подібна залежність забезпечувала активну проліферацію В-клітин із синтезом визначених антитіл.

Виходячи з уявлень про те, що одним із найбільш сильних індукторів синтезу прозапальних цитокінів виступають компоненти клітинних стінок бактерій (ліпополісахариди, пептидоглікани і мурамілдипептиди), ми визначили кореляційну залежність між концентрацією IL-8 та абсолютною кількістю ППБ в кишечнику (КУО/г).

Встановлена прямо пропорційна залежність (r = +0,63, Р = 0,0004) доводить, що цілий ряд патогенасоційованих молекулярних патернів ліпополісахаридів, пептидоглікани, молекули ДНК, бактеріальні та грибкові ліпопротеїди можуть запускати комплекс активованих медіаторів запалення на поверхні епітеліального прошарку ШКТ. При цьому клітини епітелію починають продукувати хемокіни, що приваблюють до цих місць клітини вродженого імунітету — нейтрофіли та макрофаги для фагоцитозу патогенних мікроорганізмів. У результаті розвивається імунна відповідь за першим типом (визрівають цитотоксичні Т-лімфоцити, що вбивають мікроорганізми) або за другим типом (визрівають плазматичні клітини, які продукують антитіла, що зв'язують мікроорганізми) [3, 7].

Отже, збільшення концентрації прозапальних сироваткових цитокінів IL-6, IL-8 обумовлюється індукцією великої кількості ДНК-білків, бактеріальних антигенів у слизовій кишечника, визначення їх концентрацій може використовуватись для оцінки активності запального процесу, спричиненого ППБ, прогнозу та можливості рецидивів.

У всіх дітей із кишковим дисбактеріозом I–II ст. концентрація TNF вірогідно підвищувалась порівняно з контрольною групою дітей (19,56 ± 0,83 пг/мл, Р < 0,05).

Привертало увагу, що в дітей із вираженим мікробним навантаженням синтез TNF майже з рівною частотою мав як надмірно високі значення, так і низькі. Так, у 59,2 % дітей 3-ї групи концентрація TNF вірогідно підвищувалась у межах 19,8– 27,8 пг/мл відповідно до зростання ступеня тяжкості дисбіозу (Р < 0,05), а в інших дітей його рівні були знижені, що вплинуло на середньостатистичні показники (21,78 ± 1,53 пг/мл).

Подібні ефекти можна пояснити й тим, що цитокіни здійснюють сильний вплив на продукування один одного; вони можуть включати продукцію інших цитокінів, часто підсилюють їх продукування, що викликане іншими агентами, значно рідше пригнічують його.

У результаті наших досліджень доведено зворотно пропорційну залежність між ІЛ-8 та TNF (r = –0,331, Р = 0,05) та прямо пропорційну залежність між ІЛ-6 та TNF (r = +0,325, Р = 0,012). Подібний вплив цих інтерлейкінів на взаємний синтез можна пояснити особливостями прозапального ефекту ІЛ-6, що є одним з основних прозапальних цитокінів, головним індуктором кінцевого етапу диференціації В-клітин і макрофагів, сильним стимулятором продукції білків гострої фази клітинами печінки. Одна з основних функцій IL-6 — стимуляція продукції антитіл in vivo і in vitro [8]. Ця особливість ІЛ-6 визначає його подвійну роль у розвитку запалення: будучи за своїми ефектами типовим прозапальним цитокіном, він здійснює також протизапальну дію, стимулюючи при цьому вироблення інших прозапальних цитокінів (TNF).

Біологічна сутність цього явища, що здається парадоксальною, зводиться до того, що ІЛ-6 ніби завершує формування запального процесу, виявляє значно більш високу активність в процесах активації термінальної фази диференціювання В-клітин, у присутності якого in vitro вони дуже швидко диференціюються у плазматичні IgA-клітини [7].

Деякі дослідники висловлюють думку, що надвисокі рівні TNF обумовлені зниженням ефективності його дії або нечутливістю відповідних рецепторів, що є причиною подальшої його продукції і сприяє саме підтриманню патологічного процесу [3].

Отже, у дітей із дисбіозом кишечника встановлена стимуляція продукції багатофункціонального цитокіну з вираженим прозапальним ефектом TNF, що відіграє важливу роль у протимікробному імунітеті та впливає на синтез IL-6 та IL-8.

Встановлено вірогідне підвищення відповідно до тяжкості дисбіозу кишечника концентрації IL-10: 7,26 ± 0,23 пг/мл — у 2-й та 9,80 ± 0,90 пг/мл — у 3-й групах дітей (Р < 0,05).

При проведенні кореляційного аналізу виявлено прямо пропорційну залежність між IL-10 та TNF (r = +0,417, Р = 0,014); IL-10 та IL-6/sIL-6r (r = +0,265, Р = 0,04), що доводить основну функцію IL-10 — пригнічення продукування цитокінів Т-хелперами першого типу й активованими макрофагами. Підвищення концентрації протизапального IL-10 необхідне для запобігання імунній гіперчутливості (атопії) та її лікування, полегшення перебігу запальних хвороб кишечника.

Щодо IL-4 відзначається зворотна залежність: досить високі показники у здорових дітей (1,14 ± 0,08 пг/мл) та вірогідне зниження в дітей із порушенням мікробного пейзажу кишечника I–II ст. (0,44 ± 0,51 пг/мл), що свідчило про низьку продукцію гістіоцитів, В‑лімфоцитів та збільшення цитотоксичної активності Т-лімфоцитів, макрофагів.

При зростанні ступеня бактеріальної агресії (кишковий дисбактеріоз III–IV ст.) встановлено вірогідне підвищення концентрації IL-4 (1,96 ± 0,09 пг/мл) щодо 2-ї групи, що призводило до пригнічення експресії та вивільнення прозапальних цитокінів TNF та IL-8.

Характер розподілу дітей підтверджував існування певної залежності в дітей із низькими рівнями TNF та підвищеним рівнем IL-4 (r = –0,59 ), IL-4 та sIL-6r (r = +0,335, Р = 0,05), що могло обумовлювати дефекти функціонування факторів уродженої резистентності (табл. 3).

Отримані результати доводять, що у 52 (55,4 %) дітей із дисбіозом кишечника — 39 (86,6 %) дітей 2-ї групи та у 13 (26,5 %) дітей 3-ї групи з різним ступенем активності розвиваються запальні процеси за типом Тh-1: збільшення концентрації прозапальних (IL-6, IL-8, IL-6/sIL-6R, TNF) та зниження протизапальних цитокінів (IL-4). Подібна залежність може буди обумовлена антигенним навантаженням, спричиненим персистенцією вірулентної флори (ППБ).

Поряд із цим звертали увагу суттєві коливання значень концентрацій TNF, IL-4, IL-6 у інших дітей, що ускладнювало вимірювання середньостатистичних даних.

У 42 (44,6 %) дітей з дисбактеріозом (13,3 % 2-ї та 73,5 % 3-ї групи) профіль цитокінів більшою мірою відповідав профілю Th2-імунної відповіді (підвищення IL-6, IL-4). Проліферація цих цитокінів обумовлювала перехід В-лімфоцитів в IgG-продукуючі плазматичні клітини, що не виділяються в просвіт та не здатні забезпечити захист поверхні слизової від персистуючого інфекта. Як наслідок цих процесів — активна проліферація ППБ та збільшення їх вірулентних властивостей.

Отже, результати імунологічних досліджень вказують на те, що у 86,6 % дітей зі зниженою колонізаційною резистентністю кишечника I–II ст. розвивається імунна відповідь із залученням макрофагального ланцюга: підвищується концентрація прозапальних IL-6, IL-6R та IL-8 та знижується протизапальний цитокін (IL-4), що свідчить про активацію функції клонів Th1 та стимуляцію гуморального імунітету і синтезу імуноглобулінів.

У 73,5 % дітей із дисбіозом III–IV ст. домінує імунна відповідь за Th2-типом із високою концентрацією цитокінів, що можуть впливати на склад та регенерацію преепітеліального прошарку слизу і як наслідок визначати адгезивні властивості та функції пристінної мікрофлори.