Журнал «Здоровье ребенка» 6(15) 2008

При порушенні когнітивних та асоціативних функцій в умовах церебральної патології відбуваються виражені структурні зміни тканини мозку за рахунок пригнічення процесів біоенергетики, розвитку глутаматної ексайтотоксичності, гіперпродукції токсичних форм кисню, зниження активності антиоксидантних систем, як результат — це призводить до розвитку апоптозу [1–4].

Апоптоз є однією з форм загибелі клітин, що характеризується специфічною фрагментацією ДНК, конденсацією цитоплазми, блеббінгом цитоплазматичної мембрани та мітохондріальною дисфункцією. Відомо, що апоптоз — це генетично контрольований та енергозалежний процес, що реалізується за участі специфічних протеаз і нуклеаз [5]. Поліетіологічність апоптозу асоціюється з багатьма патологічними станами, такими як гіпоксія, ішемія та інфекції. Питання про роль апоптозу в умовах ішемії мозку залишається суперечливим, однак усе більше фактів свідчать про його значущість [6, 7]. У неушкодженій клітині процес апоптозу знаходиться під суворим генетичним контролем. Зокрема, при апоптозі спостерігається експресія відповідних генів та трансляція відповідних білків. Із літературних джерел відомо, що саме гіпоксія та ішемія запускають включення генів, які індукують розвиток апоптозу. Серед цих генів, які відповідають за розвиток апоптозу в мозку, найбільш відомі індуктор CD95 АРО-1/Fas та інгібітор апоптозу Всl-2 [8]. У наш час протеїни р 53, Всl-2, Вах, МDМ, CD95 АРО-1/Fas, цитокіни розглядають як ключові фактори генетичної програми клітинної смерті, які можна використовувати для оцінки апоптозу та його основних механізмів.

Нині основним методом виявлення апоптотичних змін є імуногістохімічний метод із використанням високочутливих та високоспецифічних моно- й поліклональних антитіл, які працюють на фіксованому в формаліні матеріалі та парафінових зрізах [9].

У запуску програми апоптозу важливу роль відіграє розташований на клітинній мембрані специфічний рецептор CD95 АРО-1/Fas, утворений комплексом трансмембранних протеїнів, які входять до суперродини цитокінів. CD95 АРО-1/Fas-рецептори працюють тільки за умови поєднання трьох факторів: специфічного сигналу, експресії антигена CD95 АРО-1/Fas та функціонуючого внутрішньоклітинного шляху апоптозу [10].

Ген Всl-2 належить до протеїнів, що блокують wtp53, та є головним інгібітором апоптозу. Він локалізований у зовнішній мембрані мітохондрій, стабілізує її, управляє транспортом іонів, утворюючи іонні пори, перешкоджає виходу факторів, які індукують апоптоз (цитохром С, АІF та ін.) [11–14].

Відомо, що наявність Всl-2 у мітохондріальній мембрані обумовлює значну його роль у процесах окислювального фосфорилювання. Так, клітини з надлишком Всl-2 більш стійкі до дії різних індукторів апоптозу, таких як р53. Крім того, спостерігається підвищення потенціалу мітохондріальної мембрани, хоча невідомо, чим воно викликане — змінами вмісту АТФ чи поглинанням кисню. Всl-2 може діяти синергічно з іншими білками, підсилюючи їх дію щодо інгібування апоптозу та контролюючи шляхи передач регуляторних сигналів всередину клітин-мішеней [15–18].

Вважається, що цей білок починає діяти після репарації ушкодженої ДНК. Можливо, саме у випадку ушкодження ДНК Всl-2 перешкоджає транскрипції генів, які беруть участь в апоптозі. Не виключено також, що він блокує дію продуктів цих генів [19].

Мета роботи — дослідити морфологічні та імуногістохімічні особливості структур мозку щурят в умовах експериментальної моделі гіпоксії.

Матеріали й методи

Для досягнення мети була відтворена експериментальна модель гіпоксії за методикою, адаптованою у відділі вивчення гіпоксичних станів (за рівнем РаО2 крові) Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України [20]. Помірну гіпоксію створювали шляхом щоденного розміщення щурів починаючи з 15–17-го дня вагітності до пологів, по 2 години в камеру з газовою сумішшю О₂ + N₂, що містила 12 % кисню з поглинанням вуглекислого газу. Тяжку гіпоксію створювали, відповідно, при застосуванні суміші О₂ + N₂, що містила 7 % кисню. Тварини утримувалися в умовах 12-годинного освітлення (з 8-ї до 20-ї год. — світло, із 20-ї до 8-ї год. — темрява). Для мікроскопічного дослідження стану нейроцитів брали ідентичні шматочки тканини стовбура мозку щурят від тварин, які підлягали дії гіпоксії. Апоптоз у нейроцитах стовбура головного мозку щурів в умовах експериментальної моделі гіпоксії вивчали за допомогою імуногістохімічного методу визначення експресії генів CD95 АРО-1/Fas та Всl-2.

Відразу після забору частину біопсійного матеріалу (стовбур мозку щурят) фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну, зневоднювали у спиртах та заливали в парафінові блоки. Фарбування зрізів проводилося гематоксилін-еозином та пікрофуксином за Ван-Гізоном. Мікроскопічні дослідження здійснювали за допомогою світлооптичного мікроскопа Olimpus BH-2 (Японія).

Протокол забарвлення включав: депарафінізацію шматочків тканини на скло, блокування ендогенної пероксидази 3% розчином пероксиду водню, обробку предметного скла водою, блокування неспецифічних протеїнових сполук двома краплями 1% бичачого сироваткового антигену (BSA), промивання у фосфатному буфері рН 7,4 (PBS), обробку зрізів у цитратному буфері рH 6,0 в мікрохвильовій печі, промивання в PBS-буфері, нанесення первинних антитіл до антигена Всl-2 (фірма DAKO, Данія) на одну годину. Потім промивання в PBS-буфері і нанесення вторинних антитіл на 30 хв. Промивання в PBS-буфері, нанесення двох крапель комплексу стрептавідин-пероксидази та інкубація протягом 30 хв, промивання й нанесення АЕС-хромоген-розчину — інкубація від 5 до 20 хв до появи коричнево-червоного забарвлення з наступним дофарбовуванням гематоксиліном Майєра.

Інтенсивність реакції оцінювали напівкількісним методом у балах — від 0 до 3:

— 0 балів — немає забарвлення;

— 1 бал — слабке забарвлення;

— 2 бали — помірне забарвлення;

— 3 бали — виразне забарвлення.

Із метою кількісної оцінки експресії генів CD95 АРО-1/Fas та Всl-2 у структурах мозку щурят на декількох ділянках, які в сумі складали не менше ніж 300 клітин, підраховували кількість нейроцитів із позитивно забарвленою цитоплазмою та виражали у відсотковому еквіваленті за формулою: кількість позитивно забарвлених клітин x 100 %/300.

Дослідження було проведено на 9 щурах (самиці) та їх 20 щурятах з масою 30–35 г. Дослідну групу тварин (n = 20) було розподілено на 3 підгрупи. Першу підгрупу склали інтактні тварини (n = 8), у 2-гу підгрупу увійшли щурята, які зазнали дії помірної гіпоксії (n = 6), у 3-тю (n = 6) — дії тяжкої гіпоксії.

Обговорення отриманих результатів

Гістологічне дослідження стовбура мозку в інтактних тварин виявило незмінну структуру судин  із збереженням епітеліальної вистилки (рис. 1).

У тварин за умови перенесеної помірної гіпоксії спостерігався перивентрикулярний та перицелюлярний набряк тканин стовбура мозку (рис. 2, 3).

У стовбурі мозку щурят, які перенесли тяжку гіпоксію (3-тя підгрупа), також мав місце перицелюлярний набряк (рис. 4).

Крім того, у тканинах стовбура мозку цих тварин спостерігалися різні фази апоптозу й апонекрозу та спонгіозні вогнища. У частині нейронів відзначається набухання аксонів та наявність дендритів, які прослідковуються на великому проміжку (рис. 5). При тяжкій гіпоксії в тканинах стовбура мозку експериментальних тварин спостерігаються вогнища некрозу, тоді як у щурят із помірною гіпоксією ці явища не констатуються (рис. 6).

Особливості експресії маркерів апоптозу генів CD95 АРО-1/Fas та Всl-2 у нейроцитах щурят в умовах експериментальної моделі гіпоксії наведені в табл. 1.

При імуногістохімічному вивченні експресії генів CD95 АРО-1/Fas та Всl-2 у нейроцитах стовбура мозку інтактних щурят інтенсивність реакції в цитоплазмі, яку ми оцінювали напівкількісним методом, складала 2–3 бали (рис. 7, 8).

Отримані результати засвідчили вірогідно більший рівень експресії генів CD95 АРО-1/Fas у тварин при помірній гіпоксії, ніж у тварин із тяжкою гіпоксією (відповідно 14,2 ± 0,4; 6,2 ± 0,24; р < 0,05). У той же час рівень експресії Всl-2 тварин 2-ї підгрупи був вірогідно нижчим, ніж у щурят 3-ї підгрупи (4,6 ± 0,1 та 14,4 ± 0,4 відповідно; р < 0,05). Інтенсивність імуногістохімічної реакції в цитоплазмі в цих випадках становила 2–3 бали (рис. 9, 10).

Висновки

1. При дослідженні морфологічних та імуногістохімічних особливостей структур мозку щурят в умовах експериментальної моделі гіпоксії встановлено, що найбільші зміни у вигляді перицелюлярного та периваскулярного набряку, спонгіозних вогнищ і вогнищ некрозу, явища апоптозу й апонекрозу мали місце при тяжкій гіпоксії. У групі тварин, які зазнали дії помірної гіпоксії, ці зміни були вогнищеві.

2. Отримані дані асоціюються з даними імуногістохімічного аналізу, що встановив вірогідно більший рівень експресії гена Всl-2 і вірогідно менший рівень експресії гена CD95 АРО-1/Fas у тварин, які зазнали дії тяжкої гіпоксії, ніж у щурів за умови дії помірної гіпоксії та інтактних тварин.