Журнал «Здоровье ребенка» 6(15) 2008

Ранняя диагностика осложнений у детей с гнойно-деструктивными формами острой пневмонии остается актуальной проблемой детской хирургии в связи с широкой распространенностью заболевания, многообразием клинико-рентгенологических проявлений, тяжелым течением процесса и сохраняющейся летальностью [1].

Несмотря на снижение летальности от пневмонии за последние 50 лет на 97 %, в США и Европе она встречается с частотой от 34 до 40 случаев на 1000 детей [2].

В последнее время особое внимание уделяется пневмониям, вызываемым грамотрицательной микрофлорой, которые характеризуются ранним появлением тяжелых осложнений и неблагоприятным прогнозом [3].

Среди возбудителей внегоспитальной пневмонии грамотрицательные микроорганизмы составляют 45,4 %. В ассоциациях бактерии этой группы встречаются в 65,1 % случаев пневмоний средней степени тяжести и в 69,2 % — с тяжелым течением [3].

Считается, что именно эндотоксин (ЭТ) грамотрицательных инфекций играет одну из ведущих ролей в формировании синдрома эндогенной интоксикации. Он обладает исключительно высокой биологической активностью и относится к числу наиболее сильных экзогенных модуляторов иммунологической реактивности. Основное патофизиологическое действие ЭТ опосредуется индукцией выброса целого ряда эндогенных медиаторов воспаления, синтезируемых в основном клетками миеломоноцитарного ряда [4].

Сеть цитокинов и воспалительных молекул передает сигналы между нейтрофилами, моноцитами, макрофагами и эндотелиальными клетками. Аутокринная и паракринная активация приводит к синергизму потенцирования воспалительного ответа, если он активируется системной эндотоксинемией. В основном патологический процесс локализуется в первичном очаге инфекции (легкие). Если происходит генерализация воспалительного процесса, то это неизбежно приводит к повреждению сосудов, активации свертывающей системы и в конечном итоге — к септическому шоку [4].

Так, происходит связывание эндотоксина с плазменным белком (Lipopolysaccharide Binding Protein — LBP), который обладает высоким аффинитетом к липиду А и опосредует взаимодействие эндотоксина с мембраносвязывающим рецептором CD14 и TLR4 (toll-like receptor 4) на клетках моноцитарно-макрофагального ряда и потенцирует выработку этими клетками провоспалительных цитокинов [5, 6].

LBP имеет массу 60 kDa и связывает липиды/фосфолипиды, а также протеины с довольно широкой специфичностью. Его первичной ролью в отношении эндотоксина, как полагают, является связывание мономеров эндотоксина от бактериальной мембраны или от скопления циркулирующего эндотоксина, с последующим взаимодействием с CD14, которое приводит к целевой клеточной активации [7, 8].

Во многих исследованиях показано, что эндотелиальные клетки испытывают недостаток в mCD14 и отвечают на эндотоксин прежде всего через растворимую форму (sCD14) этого рецептора [9].

Таким образом, к гуморальным, неспецифическим механизмам индукции антиэндотоксинового иммунитета можно отнести LBP и sCD14.

К гуморальным механизмам деактивации эндотоксина можно отнести естественные антиэндотоксиновые антитела. Известно, что важную роль в клиренсе липополисахарида (ЛПС) как непосредственно в слизистых, так и в кровотоке играют антиэндотоксиновые антитела [10]. Более того, антитела к консервативным частям молекулы ЭТ можно рассматривать как универсальный интегральный маркер, одновременно отражающий реакцию организма на поступление ЭТ и характеризующий врожденный и приобретенный иммунитет к грамотрицательным микроорганизмам [11, 12].

Эндотоксин может вызывать или ускорять иммунное воспаление через множественные механизмы, которые приводят к гиперэкспрессии реактивных форм кислорода, хемотаксических и провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1, IL-8) и других острофазовых реагентов, в частности С-реактивного белка, молекул адгезии, а также к дисрегуляции рецепторных структур [6].

В наших предыдущих работах было показано, что у детей с гнойно-деструктивной пневмонией при грамотрицательной флоре наблюдается гуморальный иммунодефицит, который ассоциируется с угнетением цитокинов Т-хелперов 2-го типа (гуморальный цитокиновый профиль) и гиперсекрецией провоспалительных медиаторов. Очевидно, что такие результаты могут быть связаны с состоянием антиэндотоксинового иммунитета у данной категории больных.

В связи с этим целью нашей работы стало изучение показателей антиэндотоксинового иммунитета у больных с гнойно-деструктивными пневмониями в зависимости от формы пневмонии, типов инфекционных агентов на этапе госпитализации.

Материалы и методы

Для изучения антиэндотоксинового иммунитета при острой гнойно-деструктивной пневмонии (ОГДП) проведено исследование у 220 детей, госпитализированных в хирургическое отделение Республиканской детской клинической больницы г. Симферополя.

Из 220 больных с ОГДП у 140 (64 %) была легочная форма пневмонии, у 80 (36 %) — легочно-плевральная. Возраст больных составлял от 1 года до 14 лет.

В зависимости от тинкториальных свойств возбудителя пациенты были разделены на 3 субгруппы: с грамотрицательной, грамположительной и смешанной флорой.

Контрольную группу составили 110 условно здоровых детей того же возраста.

Количество мальчиков, девочек и их возраст в исследуемых группах статистически не отличались.

Диагноз ОГДП устанавливался на основании клинических, рентгенологических и лабораторных данных.

Уровни антиэндотоксиновых антител классов А, М, G (соответственно анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [13, 14]. В качестве антигена использовали ЛПС грамотрицательной энтеробактерии Escherichia coli K30 (O9:K30:H12), выделенной из бактериальной биомассы методом водно-фенольной экстракции и дополнительно очищенной от примесей РНК обработкой цетавлоном (Serva, Германия). Уровни анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG выражали в условных единицах оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции для разведения тестируемой сыворотки крови 1 : 50 (для анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM) и 1 : 200 (для анти-ЭТ-IgG).

Для исследования LBP и sCD14 использовали тест-системы «Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HK315» и «Hbt Human sCD14 ELISA Kit, Product Number: HK320» производства Hycult biotechnology, Голландия. Образцы и стандартные растворы инкубировали в титрационном микропланшете, покрытом антителами к LBP или sCD14. Во время инкубации LBP или sCD14 связывались с антителами, не связанный материал извлекался вымыванием. Биотинилированные вторые антитела к LBP или sCD14 добавлялись в микропланшеты, после чего проводили вторичную отмывку. Стрептавидин-пероксидазный конъюгат добавляли в образцы, после чего остаток удаляли повторным вымыванием, останавливали реакцию добавлением лимонной кислоты. Оптическую плотность определяли на анализаторе StatFox 2100 на длине волны 450 нм [15]. Содержание LBP и sCD14 выражали в мкг/мл.

Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы MedStat (серийный № MS0011) ДНПП ООО «Альфа», г. Донецк.

При анализе для проверки распределения на нормальность использовали хи-квадрат и критерий W Шапиро — Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок с использованием W-критерия Вилкоксона и сравнение средних двух независимых выборок по критерию Стьюдента. Для множественного сравнения непараметрических данных использовали ранговый однофакторный анализ Крускала — Уоллиса и критерий Данна [16].

Результаты и их обсуждение

В нашей работе для полной оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета изучали специфические (анти-ЭТ-IgA, -IgM, -IgG — приобретенный иммунитет) и неспецифические (LBP, sCD14 — врожденный иммунитет) показатели. Показатели антиэндотоксинового иммунитета представлены в табл. 1.

Статистический анализ данных табл. 1 выявил следующие закономерности. Уровень анти-ЭТ-IgG при легочной и легочно-плевральной форме был достоверно ниже (Р < 0,01) по сравнению с контролем. Кроме того, значения анти-ЭТ-IgG достоверно не отличались (Р > 0,05) между группами с легочной и легочно-плевральной формами ОГДП. В свою очередь, уровень анти-ЭТ-IgМ был достоверно выше (Р < 0,01) контроля, но его значения не отличались (Р > 0,05) между формами пневмонии. В отношении анти-ЭТ-IgА наблюдалась совершенно другая динамика: уровень этого антитела был достоверно выше (Р < 0,01) при легочно-плевральной форме по сравнению с контролем и легочной формой, а самые низкие значения анти-ЭТ-IgА были зафиксированы для легочной формы.

При анализе неспецифических показателей LBP и sCD14 (табл. 1) были получены следующие результаты: уровни LBP и sCD14 у детей с ОГДП были значительно выше (Р < 0,01) контроля.

Таким образом, анализ состояния антиэндотоксинового иммунитета показал, что гнойно-деструктивная пневмония у детей вызывает дисбаланс в системе специфического (снижение анти-ЭТ-IgG) и неспецифического (гиперэкспрессия LBP и sCD14) звена. Очевидно, что полученные результаты связаны с этиологией инфекционных возбудителей, характеристикой которых в ассоциации с показателями антиэндотоксинового иммунитета можно объяснить дисбаланс иммунного ответа.

Показатели антиэндотоксинового иммунитета в зависимости от тинкториальных свойств возбудителя представлены в табл. 2.

Уровень анти-ЭТ-IgG (табл. 2) был достоверно ниже (Р < 0,01) во всех субгруппах с легочной и легочно-плевральной формой ОГДП по сравнению с показателями контрольной группы. При сравнении соответствующих субгрупп с легочной и легочно-плевральной формой были получены следующие результаты: уровень анти-ЭТ-IgG грамотрицательной флоры легочно-плевральной формы был достоверно выше (Р < 0,01) значений аналогичной субгруппы легочной формы, а содержание анти-ЭТ-IgG в грамположительной субгруппе было выше (Р < 0,05) для легочной формы.

В отношении анти-ЭТ-IgМ (табл. 2) наблюдалась следующая картина: уровень анти-ЭТ-IgМ был достоверно выше (Р < 0,05) во всех субгруппах легочной и легочно-плевральной формы по сравнению с контролем; в свою очередь, содержание этого антитела было самое высокое (Р < 0,01) в грамотрицательной субгруппе по сравнению с грамположительной и смешанной как для легочной, так и для легочно-плевральной формы. Что касается легочно-плевральной формы, то уровень анти-ЭТ-IgМ был достоверно выше (Р < 0,05) по сравнению с легочной при парном сравнении соответствующих субгрупп.

Статистический анализ для анти-ЭТ-IgА (табл. 2) подтвердил основные закономерности, установленные нами на предыдущем этапе (табл. 1). При легочно-плевральной форме уровень анти-ЭТ-IgА был достоверно выше (Р < 0,01) во всех субгруппах, а при легочной — достоверно ниже (Р < 0,01) по сравнению с контролем.

Уровни LBP и sCD14 (табл. 2) были достоверно выше (Р < 0,01) во всех субгруппах легочной и легочно-плевральной формы по сравнению с контролем. Самые высокие значения LBP и sCD14 были зафиксированы в грамотрицательной субгруппе легочной и легочно-плевральной формы. Значения sCD14 при сравнении между формами были достоверно выше (Р < 0,05) во всех субгруппах легочной формы по сравнению с соответствующими субгруппами легочно-плевральной формы, а для LBP — аналогично, только в грамотрицательной субгруппе.

Таким образом, на данном этапе анализа мы полностью охватили спектр поставленных задач, что позволило нам перейти к обсуждению результатов.

Показано, что именно антиэндотоксиновые антитела класса M и G обладают максимальной эндотоксиннейтрализующей активностью. От формирования антиэндотоксиновых антител, относящихся к иммуноглобулину А, зависит формирование антигенспецифического секреторного иммуноглобулина А [17]. Антительный механизм нейтрализации эндотоксина является наиболее физиологичным.

Анализ специфического адаптивного антиэндотоксинового иммунитета в нашей работе показал, что гнойно-деструктивная пневмония у детей на 1-е сутки госпитализации приводит к дисбалансу антительных механизмов иммунного ответа на эндотоксин, который манифестируется значительным снижением антиэндотоксиновых антител класса G, с одной стороны, и высокими уровнями анти-ЭТ-IgM — с другой. Очевидно, что полученные результаты связаны в первую очередь с тем, что чрезмерное поступление эндотоксина может индуцировать активацию специфических В-лимфоцитов с последующим массивным выделением низкоаффинных антител класса M, а для переключения синтеза высокоаффинных антител G требуется значительный интервал времени. При легочно-плевральной форме пневмонии высокие уровни анти-ЭТ-IgА связаны с тем, что данная форма ассоциируется с эпителиальным иммунитетом плевры, а гуморальные анти-ЭТ-IgА служат основой для формирования эндотоксинспецифического секреторного иммуноглобулина А.

Известно, что различные типы инфекционных возбудителей связаны с антиэндотоксиновым иммунитетом напрямую, если возбудителем пневмонии является грамотрицательная или смешанная флора, и косвенно — при грамположительной, когда источником эндотоксина является E.coli кишечника [18].

По результатам нашей работы, антиэндотоксиновый иммунитет при грамотрицательной флоре характеризуется тем, что значения анти-ЭТ-IgG и анти-ЭТ-IgМ выше по сравнению с показателями грамположительной и смешанной субгрупп.

При дисфункции приобретенного антиэндотоксинового гуморального иммунитета нейтрализация эндотоксина, закономерно поступающего в портальный кровоток, может осуществляться другими эндотоксинсвязывающими механизмами [19].

У пациентов с хроническими инфекциями повышение уровня sCD14 коррелирует с увеличенной летальностью при бактериемии [20]. При острой воспалительной реакции уровень sCD14 и LBP увеличивается в несколько раз [21]. Повышенное соотношение LBP/sCD14, связанное с острофазовой реакцией, как полагают, играет роль в усилении эндотоксинзависимой воспалительной реакции путем увеличения уровня регулирования клеточной активации и угнетения клиренса эндотоксина [22, 23]. Интраперитонеальная инъекция LBP мышам, инфицированным ЛПС, приводит к увеличению летальности [24].

При анализе неспецифического врожденного антиэндотоксинового иммунитета нами установлено, что показатели LBP и sCD14 достоверно выше во всех субгруппах легочной и легочно-плевральной формы по сравнению с контролем. Самые высокие значения LBP и sCD14 характерны для грамотрицательной флоры.

Таким образом, гнойно-деструктивная пневмония у детей вызывает дисбаланс в системе антиэндотоксинового иммунитета, который характеризуется снижением анти-ЭТ-IgG и гиперэкспрессией анти-ЭТ-IgМ, LBP и sCD14.

Выводы

1. У детей с гнойно-деструктивной пневмонией наблюдается дисбаланс антиэндотоксинового иммунитета: уровни анти-ЭТ-IgG при легочной и легочно-плевральной форме ОГДП достоверно ниже (Р < 0,01) по сравнению с контролем и достоверно не отличаются (Р > 0,05) при легочной и легочно-плевральной форме; уровень анти-ЭТ-IgМ достоверно выше (Р < 0,01) контроля и не отличается (Р > 0,05) при разных формах пневмонии; анти-ЭТ-IgА достоверно выше (Р < 0,01) при легочно-плевральной форме по сравнению с контролем и легочной формой; уровни LBP и sCD14 значительно выше (Р < 0,01) контроля.

2. В зависимости от тинкториальных свойств возбудителя антиэндотоксиновый иммунитет характеризуется следующими изменениями: уровень анти-ЭТ-IgG грамотрицательной флоры при легочно-плевральной форме достоверно выше (Р < 0,01) значений аналогичной субгруппы легочной формы, а содержание анти-ЭТ-IgG в грамположительной субгруппе выше (Р < 0,05) при легочной форме; уровень анти-ЭТ-IgМ самый высокий (Р < 0,01) в грамотрицательной субгруппе по сравнению с грамположительной и смешанной как для легочной, так и для легочно-плевральной формы; значения LBP и sCD14 самые высокие в грамотрицательной субгруппе легочной и легочно-плевральной формы.

Перспективы дальнейших исследований. С учетом полученных данных о роли антиэндотоксинового иммунитета у больных с гнойно-деструктивной пневмонией планируется изучение иммунокоррекции у данной категории пациентов в зависимости от стадийности септического процесса и патогенетических механизмов ответа организма на эндотоксин грамотрицательной флоры.