Журнал «Здоровье ребенка» 8 (59) 2014

Статья опубликована на с. 24-28

Вступ

У даний час запально-деструктивні захворювання верхніх відділів шлунково-кишкового тракту, такі як виразкова хвороба (ВХ) та хронічний гастродуоденіт (ХГД), займають одне з провідних місць у структурі загальної захворюваності населення і має місце тенденція до збільшення частоти їх виникнення серед пацієнтів різних вікових груп [1]. У структурі хронічної гастродуоденальної патології (ХГДП) у дітей Helicobacter pylori (HP) асоційовані форми залишаються домінуючими, становлячи від 70 до 88 % [2]. Колонізація слизової оболонки (СО) шлунка НР є тригерним фактором, що запускає запальний процес. Найбільш часто він піддається хронізації [3]. Більшість дослідників погоджуються з тим, що первинне зараження НР трапляється зазвичай у дитячому віці [4, 5]. Питання про те, що визначає розвиток тієї чи іншої форми ХГДП, є найбільш складним і до цього часу не вирішеним. Більшість дослідників висловлюють припущення про провідне значення наявності вірулентних генів у геномі мікроорганізму та генетичних особливостей хазяїна [6–8].

У даний час повністю визначена нуклеотидна послідовність НР. Порівняно з іншими бактеріями геном НР відносно невеликий та становить приблизно 1600 генів. Встановлено, що геном мікроорганізму відрізняється варіабельністю, нестабільністю та здатний із високою швидкістю мутувати. Ряд генів НР продукує специфічні білки, які можна зарахувати до факторів патогенності. НР має досить широкий набір цих факторів, більшість із яких добре адаптовані до умов паразитизму цього мікроорганізму у шлунку та забезпечують його виживання в кислому середовищі шлункового вмісту та колонізацію СО. Підвищену вірулентність НР детермінують гени сagA, vacA, iceA, babA. З їх наявністю пов’язують розвиток найбільш тяжких захворювань шлунка та дванадцятипалої кишки (ДПК): атрофічний гастрит, ВХ, рак шлунка. Проте останнім часом у зв’язку з виявленням нових генів та їх продуктів спектр факторів патогенності НР розширюється [1, 7].

Встановлено, що хромосоми деяких штамів НР містять загальну специфічну послідовність, що включає понад 40 генів, названу острівцем патогенності (pathogenicity island — PAI) — генетично варіабельну ділянку, відповідальну за утворення основних факторів вірулентності бактерії та адгезію мікроорганізму до СО шлунка. Маркером PAI є цитотоксин-асоційований ген (cytotoxin-associated gen — cagA), що кодує синтез криптичного імунодомінантного протеїну — CagA. Цей білок визнаний одним з основних факторів патогенності НР та вважається відповідальним за порушення цілісності епітелію СО шлунка, індукцію неконтрольованої проліферації епітеліальних та лімфоїдних клітин, секрецію прозапальних цитокінів та виникнення запальної реакції СО. У жодної іншої бактерії не виявлений гомолог гена cagA, тому вважають, що даний ген є специфічним для НР, що виник у зв’язку з проживанням бактерії у шлунку людини [9].

Вакуолізуючий цитотоксин-асоційований ген (Vacuolating cytotoxin-associated gene — vacA) присутній у геномі всіх штамів НР, має мозаїчну структуру та містить варіабельні частини: s-регіон (кодує сигнальний пептид) та m-регіон (кодує середню ділянку білка). Описано різні за розміром та нуклеотидною послідовністю алельні варіанти цього гена: s1 або s2 та m1 або m2 відповідно. Ген vacA кодує синтез цитотоксину VacA, якому відводиться значна роль у розвитку патологічного процесу в СО. Штами s1/m1 мають найвищий рівень цитотоксичної активності. Водночас штами s2/m2 проявляють незначну токсичну активність. При будь-якому варіанті гена vacA активність цитотоксину, що ним продукується, зростає в міру зниження рН шлункового соку. Крім вакуолізації клітин шлункового епітелію, протеїн VacA надає шкідливий вплив на мітохондріальний апарат клітини, знижуючи рівень АТФ, зменшує стійкість епітеліальних клітин в умовах оксидативного стресу, дезорганізує їх цитоскелетну архітектоніку, стимулює апоптоз, інгібує клітинну проліферацію [9, 10].

Ген цитотоксичності — iceA (induced by contact with epithelium) активується при контакті з епітеліоцитами СО та існує у двох алельних формах — iceA1 та iceA2. Вважається, що алель iceA1 частіше зустрічається при ВХ, а iceA2 асоційований із гастритами [11].

Більшість HР при колонізації організму знаходяться у вільному стані, але близько 20 % приєднуються до епітеліальних клітин шлунка. Саме завдяки адгезії створюються передумови до реалізації їх патогенного потенціалу та зменшується ймовірність елімінації бактерії захисними силами організму. Адгезія відбувається за рахунок взаємодії лігандів мікроорганізму з відповідними рецепторами шлункового епітелію. У HР виявлено кілька адгезинів, із них найбільш вивчені білки Вab (blood group associated binding adhesion). Ідентифіковано декілька алелей цього гена — babA1, babА2 та babB. Як рецептори адгезини використовують залишки сіалових кислот, фосфоліпіди, гліколіпіди, сульфогрупи глікопротеїдів. Крім того, мікроби також можуть прилипати до колагену сполучної тканини, що свідчить про тропізм HР до тканин та клітин господаря. Наявність генів babA1 та babА2 в геномі НР пов’язують із ВХ ДПК та розвитком аденокарциноми [12, 13].

Формування ХГДП в більшості пацієнтів починається у дитячому віці. Частота інфікованості НР у підлітковому віці не відрізняється від дорослих. На сьогодні дослідження, що присвячені вивченню питання впливу токсигенних штамів НР на тяжкість запальних процесів у СО шлунка та ДПК у пацієнтів дитячого віку, залишаються одиничними, а їх результати — неоднозначними. Внаслідок цього вивчення впливу вірулентних штамів HР на особливості клінічного перебігу ХГДП, морфологічні зміни СО шлунка та ДПК у дитячому віці є актуальним завданням сучасної медицини.

Метою дослідження було вивчення частоти зустрічальності різних вірулентних генотипів НР у дітей із ХГДП, а також оцінка їх впливу на тяжкість захворювання.

Матеріали й методи

На базі гастроентерологічного відділення МДКЛ № 1 м. Донецька та медичного центру «Гастро-лайн» було обстежено 230 дітей із ХГДП, асоційованою з НР, віком від 8 до 17 років: 60 пацієнтів з ВХ ДПК (I група), 120 — з ерозивним бульбітом (ЕБ) (ІІ група), 50 — з поверхневим ХГД (ІІІ група).

Верифікацію клінічного діагнозу проводили відповідно до протоколів медичної допомоги дітям із захворюванням органів травлення (наказ МОЗ України № 59 від 29.01.2013 року) на основі клінічних, ендоскопічних та морфологічних (проведення прицільної біопсії СО за загальними правилами з антрального відділу та луковиці ДПК з оцінкою морфологічних змін СО відповідно до Сіднейської системи (1990, 1996)) показників.

Діагностика НР проводилася за допомогою швидкого уреазного тесту з біопсійним матеріалом, постановкою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з біоптатом та уреазним дихальним тестом із використанням тест-системи «Хелік» з індикаторними трубками («АМА», Росія).

Для ПЛР використовували біоптати СО з антрального відділу шлунка. Гени сagA, babA, iceA1, iceA2, vacA та його алельні форми s-регіону (s1 або s2) та m-регіону (m1 або m2) НР у біоптатах визначали за допомогою наборів реагентів «Хелікопол» («Літех», Росія).

Для встановлення зв’язків між факторними ознаками та ризиком розвитку клінічних проявів захворювання були залучені методи побудови математичних моделей. Для оцінки якості прогнозування моделі використовували стандартні критерії: чутливість моделі та її специфічність (при цьому розраховували інтервальні оцінки зазначених параметрів (95% довірчого інтервалу (ДІ)), а також адекватність побудованої моделі та можливість її використання на нових даних. Для перевірки адекватності застосовували метод випадкового (з використанням генератора випадкових чисел) розбиття аналізованих даних на дві множини: навчальну та тестову. Навчальна множина використовувалася для побудови моделі, тестова — тільки для підтвердження отриманої чутливості та специфічності моделі на нових даних. Для вибору найбільш значущих ознак, при використанні яких може бути вироблено ефективне прогнозування в роботі, був використаний генетичний алгоритм відбору.

Статистичний аналіз результатів проводили в пакеті MedStat, побудову та аналіз логістичних моделей — у пакеті MedCalc.

Результати та обговорення

Аналіз генетичних особливостей НР показав широку неоднорідність геному мікроба серед дітей із ХГДП. У біопсійних зразках обстежених пацієнтів були ідентифіковані всі досліджені гени НР. У всіх дітей із ВХ ДПК (100 %) та в більшості пацієнтів з ЕБ (107; 89,2 ± 2,8 %) ідентифіковані цитотоксичні штами НР.

Більшість дітей із ВХ ДПК було інфіковано cagA-позитивними штамами НР. Наявність гена cagA встановлено у 47 (78,3 ± 5,3 %) дітей, що було вірогідно частіше, ніж серед інших груп порівняння (р < 0,01). Ген vacA виявлений нами у 57 (95,0 ± 2,8 %) пацієнтів цієї групи. Аналіз алельних ділянок гена vacА показав, що для пацієнтів із ВХ ДПК характерною була наявність змішаної комбінації s- та m-регіонів. У більшості обстежених нами пацієнтів з ВХ ДПК виявлена комбінація генів vacAs1m1 та vacAs2m2. Серед дітей даної групи найбільш часто реєструвався комбінований генотип сигнальної алелі гена vacA — vacAs1s2, який виявлений у 44 (73,3 ± 5,7 %) пацієнтів цієї групи (р < 0,001). Комбінований генотип m-алелі гена vacA (vacAm1m2) встановлений у 41 (68,3 ± 6,0 %) випадку (р < 0,001). При проведенні аналізу комбінацій алелей s- та m- ділянок гена vacA встановлено, що найбільш часто мало місце поєднання змішаних алелей даного гена. Так, генотип vacAs1s2/m1m2 виявлений у 41 (68,3 ± 6,0 %) дитини з ВХ ДПК (р < 0,001). Генотип vacAs1m1, що, згідно з літературними даними, пов’язують із високою цитотоксичністю, виявлений серед даної групи пацієнтів у 13 (21,7 ± 5,3 %) спостереженнях. Важливою причиною встановленого поліморфізму генів, ймовірно, є присутність кількох штамів мікроорганізму в одного хворого. Особливістю досліджень була наявність високого відсотка зустрічальності комбінованого генотипу НР vacAs1s2/m1m2 з маркером PAI — геном cagA. Відомо, що між генами vacA та cagA НР існує взаємозв’язок. Більшість штамів vacA є cagA-позитивними — мають найбільшу активність до адгезії та призводять до найвищого ступеня колонізації СО шлунка бактеріями. При цьому комбінація cagA та різних алелей гена vacA встановлена сумарно у 44 (73,3 ± 5,7 %) пацієнтів із ВХ ДПК. Змішаний генотип cagA + vacAs1s2/m1m2 виявлений у 30 (50,0 ± 6,5 %) пацієнтів із ВХ ДПК. Ген НР iceA був встановлений у 10 (16,7 ± 4,8 %) пацієнтів із ВХ ДПК. У 7 (11,7 ± 4,1 %) дітей виявлений його алельний варіант — iceA1, а у 3 (5,0 ± 2,8 %) — iceA2. Ген вірулентності НР babA встановлений лише у 5 (8,3 ± 3,6 %) пацієнтів даної групи.

При аналізі генотипу НР у пацієнтів з ЕБ виявлені деякі відмінності в генній структурі бактерії порівняно з пацієнтами з ВХ ДПК. Не виявлено токсигенних штамів НР лише у 12 (10,0 ± 2,7 %) пацієнтів цієї групи. Генотип cagA встановлений у 70 (58,3 ± 4,5 %) дітей даної групи. Для пацієнтів з ЕБ характерною була наявність вірулентного підтипу гену VacA s1/m1, що був виявлений у 62 (51,7 ± 4,6 %) випадках та у 41 (34,2 ± 4,3 %) дитини поєднувався з геном cagA. Комбінований підтип гена vacA s1s2/m1m2 реєструвався серед дітей з ерозіями луковиці ДПК рідше порівняно з дітьми із ВХ ДПК — у 34 (28,3 ± 4,1 %) пацієнтів. Під час дослідження серед пацієнтів з ЕБ, як і серед дітей із ВХ ДПК, ми рідко виявляли такі вірулентні гени, що пов’язують у літературі з розвитком деструктивних процесів у СО шлунка та ДПК, як babA, iceA1 та iceA2. Дані генотипи у групі пацієнтів з ЕБ були ідентифіковані у 8 (6,7 ± 2,3 %), 15 (12,5 ± 3,0 %) та 5 (4,2 ± 1,8 %) дітей відповідно.

При аналізі генної структури НР у дітей із ХГД відсутність вірулентних штамів встановлено в 1/3 пацієнтів — у 16 (32,0 ± 6,6 %) випадках. Ген сagA виявлений лише в 7 (14,0 ± 4,9 %) дітей даної групи, а ген vacA встановлений у 29 (58,0 ± 7,0 %). Найбільш часто реєструвалася комбінація алелей s2m2 гена vacA в 11 (22,0 ± 5,9 %) пацієнтів. Саме ця комбінація алелей, згідно з літературними даними, є найменш цитотоксичною серед усіх підтипів гена vacA та викликає менш виражену запальну реакцію СО. Серед варіантів гена iceA у групі пацієнтів із поверхневим ХГД більш часто зустрічався його менш вірулентний алельний варіант iceA2 — у 8 (16,0 ± 5,2 %) випадках. Ген iceA1 ідентифікований у 3 (6,0 ± 3,6 %), а ген babA — лише у 2 (4,0 ± 2,8 %) пацієнтів.

На наступному етапі дослідження для виявлення факторів ризику, що визначають тяжкість розвитку ХГДП у дітей, були використані методи побудови та аналізу математичних моделей.

При проведенні аналізу як факторні ознаки при побудові математичних моделей аналізувалися 15 ознак: стать, вік пацієнтів, тривалість перебігу захворювання, дані генотипування НР, показники секреторної функції шлунка.

Побудова та аналіз моделей проводилися за результатами спостереження 230 обстежених пацієнтів із ХГДП: 50 пацієнтів із поверхневим ХГД (результат сприятливий, результуюча змінна Y = 0); 180 пацієнтів із деструктивними змінами у СО шлунка та ДПК (результат несприятливий, результуюча змінна Y = 1).

Для перевірки якості прогнозування моделі всі спостереження (з використанням генератора випадкових чисел) були розподілені на 3 множини: навчальну (використовувалася для розрахунку параметрів моделі, 181 випадок), контрольну (використовувалася для контролю за перенавчанням моделі, 20 випадків) та підтверджуючу (використовувалася для перевірки адекватності моделі при оцінці нових випадків, 29 випадків).

Була побудована модель прогнозування на підставі 15 перелічених факторних ознак. Чутливість моделі на навчальній множині становила 96,5 % (95% ДІ 92,7–98,9 %), специфічність — 95,0 % (95% ДІ 85,9–99,6 %). На підтверджуючій множині чутливість моделі становила 95,8 % (95% ДІ 83,6–100 %), специфічність — 100 % (95% ДІ 65,6–100 %). Модель адекватна — чутливість та специфічність на навчальній та підтверджуючій множинах статистично значимо не відрізнялася (p = 0,66 та p = 0,52 відповідно при порівнянні за критерієм x²).

Для виявлення факторів, що найбільшою мірою пов’язані з ризиком розвитку ерозивно-виразкових змін СО шлунка та ДПК, був проведений відбір найбільш значущих ознак із використанням методу генетичного алгоритму відбору. У результаті було відібрано 4 факторні ознаки: гени сagA (X1), vacAs1s2 (X2), vacAm1 (X3) та тривалість захворювання (X4). На виділеному наборі факторних ознак була побудована модель прогнозування ризику розвитку деструктивних змін СО. Чутливість цієї моделі на навчальній множині становила 95,7 % (95% ДІ 91,8–98,5 %), специфічність — 95,0 % (95% ДІ 85,9–99,6 %). На підтверджуючій множині чутливість моделі становила 95,8 % (95% ДІ 83,6–100 %), специфічність — 100 % (95% ДІ 65,6–100 %). Чутливість та специфічність на навчальній та підтверджуючій множинах статистично значимо не відрізнялася (p = 0,60 та p = 0,52 відповідно при порівнянні за критерієм x²), що свідчить про адекватність побудованої моделі. При зниженні кількості факторних ознак від 15 до 4 прогностичні характеристики статистично значимо не змінилися (p > 0,05), що є підтвердженням значимості чотирьох виділених факторних ознак: гени сagA, vacA s1s2, vacA m1, тривалість захворювання для прогнозування ризику розвитку ерозивно-виразкових змін СО шлунка та ДПК.

Висновки

Таким чином, згідно з даними проведеного генотипування НР у дітей із ХГДП можна зробити висновок, що в дитячому віці розвиток запально-деструктивних процесів СО шлунка та ДПК асоційований із персистенцією певних штамів НР. Так, у дітей розвиток ерозивних змін у СО ДПК, що відбуваються напередодні формування ВХ, пов’язаний із впливом штамів НР, що мають комбінований вірулентний генотип cagA + vacAs1/m1. Подальше прогресування захворювання та розвиток виразкових дефектів СО супроводжується зміною генотипу НР, що може відбуватися внаслідок персистенції кількох штамів НР в одного й того ж хворого, які мають у структурі генотипу як високовірулентну алель гену vacA — s1/m1, так і менш вірулентну — s2/m2. Саме комбінація генотипів НР cagA + vacAs1s2/m1m2 призводить до ще більшої активації запалення та розвитку виразкових дефектів і є характерною для дітей із ВХ ДПК. При побудові математичних моделей прогнозування ризику розвитку деструктивних змін СО шлунка та ДПК підтверджено, що найбільш значущими факторами у формуванні цих процесів є інфікованість дитини цитотоксичними штамами НР із наявністю сagA, vacA s1s2, vacA m1 генів. Крім того, великий вплив на тяжкість запального процесу у СО має тривалість перебігу ХГДП у дітей. Наявність генів iceA та babA у структурі геному НР не є характерною для пацієнтів із ХГДП у дитячому віці.