Журнал «Здоровье ребенка» 1 (60) 2015

Статья опубликована на с. 173-180

Введение

При инфекционно-воспалительных заболеваниях бронхолегочной системы в ответ на провоспалительные стимулы эпителиальные клетки респираторного тракта, активированные альвеолярные макрофаги и нейтрофилы продуцируют супероксид анион-радикал (O₂^–•) и монооксид азота (NO), которые обладают мощными бактерицидными свойствами и являются важнейшими компонентами неспецифической противоинфекционной защиты человеческого организма [13, 41]. Активированные кислородсодержащие (АКМ) и азотсодержащие метаболиты (ААК) образуются в организме в результате нескольких химических реакций (табл. 1).

Общая характеристика активированных кислородсодержащих метаболитов

Считают, что в организме человека 2–5 % поглощенного кислорода превращается в АКМ. Активированные кислородсодержащие метаболиты — это свободные радикалы, у которых на внешней электронной оболочке находится неспаренный электрон. Основными представителями АКМ являются: радикальные супероксид анион-радикал (O₂^–•), гидроксильный (OH^•) и гидропероксидный (HO₂^•) радикалы, карбонатный радикал (CO₂^•), RO₂^•, RO^• и нерадикальные дериваты кислорода — перекись водорода (H₂O₂), синглетный кислород (¹О₂), озон (O₃). Средняя концентрация АКМ в тканях человека в физиологических условиях составляет 10^–8 ммоль. У млекопитающих основными генераторами АКМ являются фагоцитирующие клетки: гранулоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы. Мембраны фагоцитов содержат ферментативный комплекс — никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН)-оксидазу. В фагоцитах активация комплекса НАДФН-оксидазы сопровождается развитием «окислительного взрыва» — избыточного образования O₂^–• [3, 39, 43]. Во время респираторного взрыва профессиональные фагоциты могут высвободить от 3 до 4 нмоль АКМ на каждый миллион клеток в минуту. Большая часть образованной и высвобожденной во внеклеточное пространство H₂O₂ диффундирует через плазматические мембраны в клетку [17]. Основными генераторами H₂O₂ в респираторном тракте являются фагоциты и эпителиоциты (табл. 2).

Активированные кислородсодержащие метаболиты являются важнейшими компонентами неспецифической защиты от инфекционных агентов. Концентрация АКМ во внутреннем пространстве фагосом достигает высокого уровня: супероксидного анион-радикала — 30 мкмоль, перекиси водорода при отсутствии миелопероксидазы — более 100 мкмоль [17]. Показано, что уровень содержания АКМ, в частности H₂O₂, в конденсате выдыхаемого воздуха у пациентов с острыми инфекционно-воспалительными заболеваниями респираторного тракта значительно выше, чем у здоровых людей [29]. Исследования содержания H₂O₂ в конденсате выдыхаемого воздуха у людей как в состоянии здоровья, так и при различных заболеваниях позволили установить, что хроническое воспаление и гипоксические состояния сопровождаются повышением концентрации H₂O₂ в выдыхаемом воздухе (табл. 3). Так, у больных бронхиальной астмой концентрация Н₂О₂ в конденсате выдыхаемого воздуха может быть в 6 раз, а у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) — в 20 раз выше, чем у здоровых людей [16, 23].

Длительное течение воспалительного процесса может привести к снижению количества реснитчатых клеток и, как следствие, дефициту бактерицидной активности бронхиального секрета. Превышение внутриклеточной концентрации Н₂О₂ уровня в 10 мкмоль/л токсично для эпителиоцитов [31].

Нарушение окислительно-восстановительного равновесия, обусловленное генерацией АКМ, активирует множество АКМ-сенситивных внутриклеточных сигнальных путей, которые индуцируют продукцию провоспалительных и апоптотических медиаторов, играющих ключевую роль в защите организма. Помимо активации фагоцитирующих клеток основными причинами, которые могут привести к значимому увеличению генерации АКМ, являются: нарушение транспорта электронов в электронтранспортной цепи митохондрий; индукция гиперметаболизма; возбуждение системы ксантин-ксантиноксидазы; увеличение пула ионов металлов с переменной валентностью. Высокий уровень концентрации АКМ обусловливает окисление липидов, белков и нуклеиновых кислот, лишая их первичной физиологической активности, и деградация молекул-мишеней. АКМ, вступая во взаимодействие с протеинами, липидами, нуклеиновыми кислотами клетки, инициируют вторичные свободнорадикальные реакции. Агрессивное действие АКМ может лежать в основе ускорения процесса старения и развития сердечно-сосудистых, аутоиммунных и других заболеваний [2, 11, 12, 15, 26].

Генераторы АКМ

Краткая характеристика НАДФН-оксидазы и других представителей семейства NOX

В клетке основным источником электронов является электронтранспортная цепь митохондрий (табл. 4).

В связи с этим основное количество O₂^–• образуется в митохондриях (рис. 1) [8, 36].

В электронтранспортной цепи митохондрий, кроме 4-электронного восстановления О₂ до Н2О, происходит и 1-, 2-, 3-электронное восстановление с образованием АКМ (рис. 2) [3, 6].

Генерация O₂^–• в организме человека также осуществляется ксантиноксидазой, ксантиндегидрогеназой, альдегидоксидазой, микросомальными монооксигеназами, цитохромом P⁴⁵⁰, тираминазой, липооксигеназой, циклооксигеназой и др. В настоящее время известно более 1000 ферментов класса оксидаз и оксигеназ и около 1200 генов, кодирующих их структуру. Донорами электронов являются ионы металлов с переменной валентностью, преимущественно Fe²⁺, а также Cu²⁺, которые включены в каталитический центр молекул ферментов. Из рецепторассоциированных генераторов O₂^–• определяющим ферментом является НАДФН-оксидаза, которая окисляет НАДФН до НАДФ⁺ за счет восстановления O₂ до супероксид аниона-радикала: НАДФН + 2O₂ НАДФ⁺ + 2O₂^–•. В отличие от других оксидоредуктаз НАДФН-оксидаза является «профессиональным» продуцентом АКМ [3, 4, 30, 34].

Мультикомпонентный флавожелезопротеид — НАДФН-оксидаза — терминальный ферментный электронный акцептор внутриклеточной электронтранспортной цепи митохондрий. Молекула НАДФН-оксидазы состоит из шести гетеросубъединиц, которые в неактивном состоянии пространственно разобщены во внутриклеточном континууме клетки (табл. 5) [22].

Такие субъединицы НАДФН-оксидазы, как большой гликопротеин gp91^phox и маленький протеин p22^phox, связаны с цитоплазматической мембраной клетки, а p67^phox, p47^phox, p40^phox и представитель семейства Rho малых ГТФаз (Rac1 или Rac2) расположены в цитоплазме клетки [14, 35].

Две протеиновые мембраносвязанные оксидазные субъединицы НАДФН-оксидазы — gp91^phox и p22^phox — формируют гетеродимерный флавоцитохром b558 (Сyt_b558), который составляет каталитическое ядро фермента (рис. 3) и в отсутствие других цитоплазматических субъединиц НАДФН-оксидазы, играющих преимущественно регулирующую роль, пребывает в состоянии покоя [14, 21, 42].

Протеины Rac семейства Rho малых ГТФаз представляют собой молекулярные «выключатели», которые регулируют разнообразные внутриклеточные сигнальные пути, активирующие адгезию, фагоцитоз, цикличность жизни клетки, обеспечивающие взаимодействие мембранных рецепторов и цитоскелета клетки. В неактивном состоянии Rac находятся в тесной ассоциации с протеином RhoGDI. Активация Rac играет ключевую роль в процессе фагоцитоза и влияет на процесс активации киназ, участвующих в фосфорилировании компонентов НАДФН-оксидазы [20, 21].

В течение последнего десятилетия было продемонстрировано, что НАДФH-оксидазная активность характерна и для нефагоцитирующих клеток. Исследования данного феномена привело к открытию различных изоформ НАДФH-оксидазы, которые были объединены в семейство ферментов NOX. Семейство NOX представляют гомологические формы субъединицы gp91^phox, физиологической функцией которых является генерация супероксид аниона-радикала [28, 38]. Семейство NOX включает в себя семь ферментов — NOXL, NOX2 (gp91^phox), NOX3, NOX4, NOX5, DUOX1, и DUOX2. Молекулярная структура всех представителей семейства NOX состоит из 6 трансмембранных областей с двумя железосвязывающими регионами и длинного цитоплазматического C-терминального домена, который содержит флавинаденина динуклеотид (ФАД)- и НАДФ-связывающие регионы. Протеины NOX5, DUOX1 и DUOX2 отличаются удлиненным N-терминальным доменом и наличием внутриклеточных EF-рука-Ca²⁺-связывающих доменов (рис. 4) [9, 30].

Для ферментов семейства NOX характерна тканеспецифическая экспрессия. NOX1 преимущественно экспрессируется в толстой кишке и обнаруживается в эпителиоцитах респираторного тракта, в тканях матки и простаты; NOX2 (gp91^phox) — в нейтрофилах, моноцитах, макрофагах, эозинофилах; NOX3 — исключительно в кортиевом органе, спиральных ганглиях внутреннего уха, эндотелиоцитах; NOX4 — в тканях почки, сердца, поджелудочной железы, поперечнополосатых и гладких мышцах, яичнике, яичках, эндотелии, остеокластах, фибробластах, астроцитах; NOX5 — в лимфоидных тканях и яичке, преимущественно в сперматоцитах; DUOX1 — в ткани щитовидной железы и в эпителии респираторного тракта, DUOX2 — в ткани щитовидной железы и в эпителии респираторного и пищеварительного тракта [25, 27]. Представители семейства NOX локализованы в различных компартментах клетки. Так, NOX1 находится в кавеолиновых ямках клеточной мембраны, NOX2 — в мембранных участках, формирующих фагосому, и на ламеллиподии.

Также NOX1 и NOX2 локализуются на мембранах «редоксом» — эндосом, ответственных за раннюю рецепторопосредованную сигнализацию в нефагоцитирующих клетках. Внутриклеточная локализация протеина NOX3 изучена недостаточно, он преимущественно связан с цитоплазматической мембраной. NOX4 идентифицируется на мембранах ядра и эндоплазматического ретикулума, где он взаимодействует с киназами и фосфатазами. NOX5 находится на внутренних мембранах клетки, DUOX1/2 — на цитоплазматической мембране клетки [9]. В отличие от NOX2 фагоцитирующих клеток другие изоформы NOX нефагоцитирующих клеток не ограничиваются локализацией на клеточной мембране [7]. Уровень экспрессии DUOX1 и DUOX2 эпителиоцитами респираторного тракта в 1000 раз выше, чем других изоформ NOX [37]. Краткая функциональная характеристика представителей семейства NOX представлена в табл. 6.