Журнал «Здоровье ребенка» 3 (63) 2015

Статья опубликована на с. 122-126

Введение

На протяжении длительного периода изучения активированных кислородсодержащих метаболитов (АКМ) единственно полезным для макроорганизма их физиологическим эффектом считалось бактерицидное действие [2]. В последние годы появились доказательства, что АКМ являются внутриклеточными мессенджерами, которые играют важнейшую роль в регуляции активности внутриклеточных сигнальных молекулярных структур, модулирующих генную транскрипцию, скорость клеточной пролиферации, канализированность цитодифференцировки, характер клеточных реакций, процессы воспаления, апоптоза [9, 30].

Мессенджерная активность АКМ

В настоящее время идентифицированы бактериальные редокс-сенсоры (OxyR, SoxR редокс-чувствительные факторы транскрипции, молекулы шаперона Hsp33, FNR датчик кислорода и др.). Молекулы редокс-сенсоров характеризуются структурными особенностями, которые позволяют им «ощущать» конкретные АКМ и передавать возбуждение компонентам внутриклеточных сигнальных путей. В процессе эволюции простые бактериальные редокс-сенсоры были усовершенствованы или заменены на более специализированные протеины, такие как тиоловые пероксидазы дрожжей (ферменты, принадлежащие к семейству пероксиредоксинов или глутаредоксинов), факторы транскрипции Yap1 и Rap2.4a. У млекопитающих основными редокс-сенсорами являются: фактор транскрипции, индуцируемый гипоксией (HIF); ядерный фактор 2, подобный эритроидному деривату-2 (NRF-2); хлоридный внутриклеточный канал 2-го типа (chloride intracellular channel 2 — CLIC-2); рецептор-зависимый катионный канал переходного потенциала субсемейства M (transient receptor potential cation channel, subfamily M — TRPM); гомолог фосфатазы и тензина (phosphatase and tensin homolog — PTEN); рецептор продуктов конечного гликозилирования (receptor for advanced glycation endproducts — RAGE); протеин группы высокой мобильности бокс-1 (HMGB-1/амфотерин) (рис. 1) [26, 33].

Спектр пато- или физиологического действия АКМ во многом зависит от уровня их продукции. Умеренное увеличение внутриклеточного уровня cупероксидного анион-радикала (O₂^–•) приводит к образованию перекиси водорода (H₂O₂) в микромолярных концентрациях, что обусловливает пролиферацию различных типов клетки. В многочисленных исследованиях последних лет было установлено, что Н₂О₂ является одной из ключевых молекул внутриклеточной сигнализации, которая участвует в регуляции метаболизма клетки и является посредником митогенного эффекта активации рецепторов факторов роста. АКМ регулируют аутофагию, проницаемость ионов кальция мембран митохондрии, высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума. Чуть в более высоких концентрациях Н₂О₂ вызывает «арест» клеточного цикла или апоптоз клетки, а в милимолярных концентрациях может стать причиной выраженного окислительного повреждения внутриклеточных структур и некротической гибели клетки [13, 37].

Деструктивное действие АКМ

Чрезмерная продукция АКМ может стать причиной гибели эпителиоцитов и других клеток легочной ткани при острых и хронических заболеваниях органов дыхания. АКМ-индуцированное поражение ткани респираторного тракта при различных воспалительных заболеваниях является одним из основных патогенетических факторов, обусловливающих как тяжесть, так и течение болезни [3, 14, 15]. В основе повреждающего действия АКМ лежит окисление липидов, протеинов ДНК. Гидроксильные радикалы обусловливают перекисное окисление липидов, протекающее по типу цепной реакции, цитоплазматической мембраны и любых внутриклеточных органелл. Свободные аминокислоты и протеины также являются мишенью для окислительного повреждения. Окисление боковых цепей молекул аминокислот приводит к образованию карбонильных групп (альдегиды и кетоны). К оксидантной атаке особенно чувствительны такие аминокислоты, как пролин, аргинин, лизин и треонин. Окисление тиоловых групп цистеиновых аминокислотных остатков может привести к образованию дисульфидных связей и возникновению аномальной структуры протеина. Нарушение структуры белка приводит не только к потере им функциональной активности, но и к агрегации белков и гибели клеток. ДНК является основным субстратом супероксид анион-радикала. Окисление сахарных остатков нуклеотидов может стать причиной обрыва нити ДНК, окисление гистоновых белков протекает с формированием перекрестных связей, которые нарушают декомпактизацию хроматина и, как следствие, транскрипцию генов и репарацию ДНК. Влияние АКМ может привести к возникновению мутаций. Особенно уязвима митохондриальная ДНК. Повреждение митохондриальной ДНК даже при физиологических условиях происходит в пять-десять раз чаще, чем ядерной ДНК [6].

Примеры действия АКМ на липиды, протеины и ДНК приведены ниже.

Повреждение липидов, белков и ДНК активными кислородсодержащими метаболитами [31]

Окислительное повреждение липидов:

— Нарушение функционирования и целостности липидного бислоя клеточной мембраны.

Окислительное повреждение протеинов:

— Фрагментация пептидной цепи.

—  Агрегирование продуктов деградации сшитых продуктов.

— Изменение электрического заряда молекулы.

— Повышение чувствительности к протеолитическим ферментам.

— Сайт-специфическая модификация аминокислот (аминокислоты отличаются по своей восприимчивости к действию АКМ).

— Окисление специфических аминокислот «отмечает» протеины для деградации специфическими протеазами.

— Окисление Fe-S-центров.

Окислительное повреждение ДНК:

— Делеция, транслокация.

— Деградация, однонитевые поломки.

— Образование сшивок белков и ДНК.

Процессы окисления протеинов, липидов и нуклеиновых кислот избыточными концентрациями АКМ в респираторном тракте подробно рассмотрены в обзорах Irfan Rahman [25], Marian Valko и соавт. [29], Jean Cadet и соавт. [7, 8], Gabriella Leonarduzzi и соавт. [19], Zsolt Radak и соавт. [1].

Антибактериальное действие АКМ

При инфекционном поражении респираторного тракта происходит возбуждение эпителиоцитов, альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, которое характеризуется значительным увеличением концентрации АКМ как во внутритканевом пространстве, так и в бронхоальвеолярной жидкости [22]. Киллинг микроорганизмов АКМ осуществляется за счет непосредственного окисления молекулярных структур инфекционных агентов или опосредованно через активацию нейтрофильных протеаз супероксидным анионом радикалом и перекисью водорода [24, 35].

Функциональное взаимодействие АКМ и нейтрофильных протеаз увеличивает скорость эрадикации инфекционных агентов в нейтрофилах, находящихся в состоянии покоя, субъединицы gp91^phox и p22^phox преимущественно локализованы в мембране вторичных гранул. Во время активации нейтрофилов происходит слияние первичных (азурофильных) и вторичных гранул с фагоцитарной вакуолью, в которой компоненты их содержимого взаимодействуют между собой. Одним из эффектов этого взаимодействия является активация нейтрофильных сериновых протеаз, содержащихся в первичных гранулах [18]. Представляет интерес тот факт, что мыши с дефицитом нейтрофильной эластазы отличаются склонностью к развитию септического процесса при инфицировании грамотрицательными бактериями, в то время как катепсин-G (CG)-дефицитные мыши достаточно устойчивы к бактериальным инфектам. Оценивая вклад НАДФH-оксидазы и сериновых протеаз в антибактериальную защиту организма, R. Robert Vethanayagam и соавт. [28] установили, что НАДФH-оксидаза является несомненно более значимым компонентом этого процесса.

Супероксидный анион-радикал (O₂^–•)

В настоящее время существуют различные и в некоторой степени противоречивые данные об участии супероксидного анион-радикала (O₂^–•) в непосредственном киллинге микроорганизмов. Однако было показано, что при низких уровнях рН O₂^–• может быть прямым эффективным участником бактериального киллинга [24].

Перекись водорода

Перекись водорода, окисляя детерминанты клеточной стенки, играет важнейшую роль в киллинге бактерий. Во внутреннем пространстве фагосомы отмечается высокий уровень содержания АКМ. И хотя этот уровень концентрации АКМ ниже, чем те, которые необходимы для проявления антибактериального действия в условиях in vitro, в условиях фагосомы он достаточно эффективен. Считают, что концентрация АКМ в пространстве фагосомы распределена неравномерно, основное их содержание сосредоточено в непосредственной близости от инфекционного агента [12]. Используя H₂O₂, миелопероксидаза (MPO) нейтрофилов при физиологических концентрациях галоген-анионов генерирует мощный окислитель — гипохлорную кислоту, которая как сама, так и образующиеся при дальнейших ее преобразованиях радикалы обладают выраженным бактерицидным и противогрибковым действием. Определенную роль в бактериальном киллинге также играют производные взаимодействия лактопероксидазы с анионом тиоцианита и анионом йода.

Пероксинитрит

Супероксидный анион-радикал активно реагирует с монооксидом азота, образуя высокореактивный пероксинитрит, который обладает мощным бактерицидным действием [23].

Инактивация факторов вирулентности инфекционных патогенов

Показано, что АКМ не только оказывают бактерицидное действие, но и инактивируют различные факторы вирулентности патогенных микроорганизмов. Так, показано, что окисление АМК метионинового остатка в С-терминальном регионе молекулы бактериальных аутоиндукторов ингибирует активность кворум сенсинга, предупреждая организацию бактериальной биопленки [4, 20].

Регуляция рН и концентрации ионов в фагосоме

Генерируемые NOX2 АКМ, изменяя внутрифагосомальный уровень рН, концентрации ионов водорода и калия, обусловливают гибель патогенных микроорганизмов. Активация NOX2 приводит к увеличению концентрации O₂^–• в фагосомах и как следствие — к повышению регионального уровня рН. Emer P. Reeves и соавт. [27] показали, что повышение концентрации O₂^–• в фаголизосоме сопровождается увеличением как концентрации ионов K⁺, так и уровня pH. Активация NOX2 ассоциирована с компенсаторным усилением притока ионов H⁺ и K⁺ в фагосому, что изменяет осмолярность среды и увеличивает аффинность катионных протеаз, способствуя повышению активности бактериального киллинга. Щелочные условия и высокий уровень концентрации K⁺ усиливают протеолитическую деятельность эластазы и катепсина G — мощных эффекторов процесса бактериального киллинга (рис. 2) [4].

Участие АКМ в организации нейтрофильных внеклеточных ловушек

Под влиянием АКМ нейтрофилы во время инфекционного процесса «выбрасывают» сетевидные образования, которые получили название нейтрофильных внеклеточных ловушек — НВЛ (NET — Neutrophil Extracellular Traps) [32]. Выброс НВЛ сопровождается гибелью нейтрофилов — НВЛозом и высвобождением большого количества различных биологически активных веществ, в том числе и обладающих антибактериальной, антигрибковой и противовирусной активностью [21]. Также НВЛ образуются при активации нейтрофилов форболмиристатацетатом, IL-8/CXCL8 и некоторыми РАМР, в частности LPS. НВЛ представляют собой сети из гладких волокон с диаметром 15–17 нм, которые состоят из деконденсированного хроматина и содержат разнообразные пептиды и антимикробные факторы (BPI, L37, адреномедуллин, азуроцидин, гистоны Н1, Н2А, H2B, H3, H4, желатиназа, кальпротектин, каталаза, катепсин G, лактоферрин, лизоцим, MPO, миозин-9, нейтрофильная эластаза). ДНК является основным структурным компонентом НВЛ. Объемная сетевая структура НВЛ обеспечивает фиксацию патогенов, а высокая локальная концентрация антимикробных веществ — гибель микроорганизмов. НВЛ-ассоциированный бактериальный киллинг является высокоэффективным механизмом уничтожения грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе и таких респираторно-тропных инфекционных агентов, как Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes [5, 11, 34, 36].

Считают, что нарушение формирования АКМ-индуцированного НВЛ-ассоциированного внеклеточного бактериального киллинга является важнейшим звеном патогенеза системного инфекционного процесса у новорожденных [16, 17].